cAMP反应元件结合蛋白在LPS致肺微血管内皮细胞损伤过程中的作用

徐秀娟，孙耕耘，尤青海，张 丹

（安徽医科大学第一附属医院呼吸内科，安徽合肥 230022）

肺微血管内皮细胞（pulmonarymicrovascular endothelial cells，PMVEC）是肺微循环屏障的重要组成部分，当发生急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）时，PMVEC通透性增加、肺间质及肺泡水肿是ARDS发生的病理生理基础，因此，研究 PMVEC损伤的调控机制对寻找ARDS的防治措施具有重大意义。多种炎症介质错综复杂的相互作用是ARDS发病的重要环节，其本质是失控性全身炎症反应在肺部的体现，多种炎症介质贯穿该过程，炎症介质作为第一信使激活细胞内的众多信号转导通路，将信号携致细胞核内，活化特定的核转录因子调控相应基因的转录，从而促进或抑制炎症反应。

CREB是一种重要的核转录因子，能被CREB活化后转录的靶基因超过5 000种，它们参与细胞物质代谢［1］、免疫反应［2］、炎症反应［3－4］等过程。但CREB是否在LPS诱导的RPMVEC炎症损伤中起作用及其中的机制尚不清楚。为此，本实验通过LPS建立大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cell，RPMVEC）单层损伤模型，观察LPS对CREB及其磷酸化的作用，并探讨CREB磷酸化对RPMVEC单层通透性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 Dulbecco改良Eagle高糖培养基干粉（DMEM）及胎牛血清（美国Gibco公司）；兔抗鼠p-CREB（Ser133）多克隆抗体、兔抗鼠CREB多克隆抗体（美国CST公司）；HRP标记的羊抗兔IgG抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL底物发光试剂盒（美国 Pierce公司）；白蛋白（美国 Sigma公司）；V5681（美国 Promega公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；余实验试剂为国产分析纯。

1.1.2 实验动物 健康♂、体质量100～120 g、SPF级SD大鼠购自安徽省实验动物中心［合格证号：SCXK（皖）2011－002］。

1.2 方法

1.2.1 实验分组和处理 （1）量效组：0.1、1、10、100 mg·L－1LPS分别刺激 RPMVEC 30 min后，检测p-CREB及CREB，设正常组对照；（2）时效组：10 mg·L－1LPS分别刺激 RPMVEC 10、30、60、120 min，检测 p-CREB及CREB，设正常组对照；10 mg·L－1LPS分别刺激 RPMVEC 1、3、6、12、24 h，检测CREB及GAPDH，设正常组对照；（3）PKA通路组：10μmol·L－1V5681与RPMVEC预孵育0.5h后，再加入10 mg·L－1LPS继续孵育，30 min后检测 p-CREB及CREB，3 h后检测通透系数，设正常对照组、V5681组和LPS单独刺激组。

1.2.2 RPMVEC分离培养与鉴定 参照本实验室建立的实验方法进行，RPMVEC鉴定结合显微镜下呈典型的“铺路石样”排列的形态学特征、Ⅷ因子相关抗原和FITC标记的异植物凝集素结合试验阳性［5］。

1.2.3 Western blot检测 RIPA裂解液裂解RPMVEC后，12 000 r·min－1、4℃离心 10 min，留取上清。参照BCA浓度测定试剂盒将上清蛋白调至2 g·L－1。12%分离胶和5%积层胶进行蛋白电泳（上样量均为20μl），蛋白转至硝酸纤维素膜上，PBS-T溶液封闭，兔抗鼠CREB（稀释浓度为1∶800）、p-CREB多克隆抗体（稀释浓度为1∶1 000）4℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG溶液（稀释浓度为1∶10 000）室温孵育1 h，ECL法显影，扫描仪扫描存盘，结果用Bio-Rad Quantity One软件分析。

1.2.4 PMVEC单层通透性的检测 参考文献［6］略改进伊文思蓝－白蛋白法，倒置显微镜判断 Transwell上 RPMVEC单层融合后，PBS充分漂洗含RPMVEC单层的Transwell小室3次，上室中加入终浓度为0.67 g·L－1伊文思蓝－白蛋白液100μl，下室中加入4%白蛋白液600μl，置于37℃、5%CO2孵箱孵育1 h，分别从下室提取样品，全自动酶标仪检测620 nm波长处OD值。根据标准曲线得出上、下室伊文思蓝－白蛋白浓度，按公式计算RPMEVC的通透系数。通透系数（cm/s）＝（［A］/t）×（1/A）×（V/［L］）。其中［A］是下室伊文思蓝 －白蛋白浓度，t（s）是时间间隔，A（cm2）是 Transwell表面积，V（m3）是下室溶液体积，［L］是上室伊文思蓝－白蛋白浓度。

1.2.5 统计学处理 数据以±s表示，SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，多组变量间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2．1 LPS刺激对RPM VEC中CREB磷酸化水平的影响随着 LPS孵育浓度的增加（0、0.1、1、10、100 mg·L－1），CREB中 Ser133位点磷酸化水平逐渐增加，各组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），见 Fig 1A；10 mg·L－1LPS作用于 RPMVEC 10 min后，CREB中Ser133位点磷酸化水平明显升高，30min达高峰，随后开始下降，120min仍高于基础水平，各组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见Fig 1B。

Fig 1 Effect of LPS on phosphorytation ceuels of CREB in RPMVEC（±s，n＝6）

2．2 不同时相的 LPS刺激对 RPMVEC表达CREB的影响10 mg·L－1LPS与RPMVEC共孵育后，CREB表达量于1 h开始升高，3 h达峰值，随后逐渐下降，至孵育24 h表达水平仍高于正常对照组，各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05），见Fig 2。

2．3 V5681对LPS诱导RPMVEC中CREB磷酸化水平的影响与正常对照组相比，10 mg·L－1LPS刺激RPMVEC使CREB中Ser133位点磷酸化水平明显升高（P＜0.05）；加入PKA特异性通路抑制剂V5681预孵育后，LPS诱导的CREB中Ser133位点磷酸化水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），见Fig 3，可见PKA通路介导了LPS诱导的RPMVEC中CREB磷酸化过程。

Fig 2 Effect of 10 mg·L－1 LPS on the expression of CREB at different time in RPMVEC（±s，n＝6）

Fig 3 Effect of V5681on phosphorylation levels of CREB induced by LPS in RPMVEC（±s，n＝6）

2．4 V5681对LPS诱导RPMVEC通透性变化的影响与正常对照组相比，10 mg·L－1LPS刺激使RPMVEC的通透性明显增加（P＜0.05）；而10μmol·L－1V5681与10 mg·L－1LPS共孵育后，RPMVEC通透性较单纯10 mg·L－1LPS刺激组明显增加（P＜0.05）；与正常对照组相比，V5681单独作用也可增加细胞单层通透性，差异具有统计学意义（P＜0.05），见 Tab 1。

Tab 1 Effect of V5681 on permeability induced by LPS in RPMVEC（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of V5681 on permeability induced by LPS in RPMVEC（±s，n＝6）

*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs LPS group.

Group Permeability/cm·s－1 Control 87.41±2.28 LPS 134.35±1.35*V5681 98.64±1.35*LPS＋V5681 156.50±3.08*＃F 666.60 P ＜0.05

3 讨论

CREB广泛存在于真核生物细胞核内，是一种通过磷酸化起作用的转录因子，能调控基因启动子中含有CRE的目的基因转录，它位于PKA通路下游，许多与PKA信号通路相关的重要生物学事件均是由CREB磷酸化介导的。CREB的一级结构由341个氨基酸残基构成，二级结构包括1个激酶诱导域、2个富含谷氨酸区域和1个基础亮氨酸拉链结构域，前两者对CREB活化和磷酸化至关重要，Ser133是其最主要的磷酸化位点，多种蛋白激酶均能诱导 Ser133残基磷酸化［7］，如 PKA、PKC、MAPK。

有关CREB的研究主要集中于神经系统，如生物节律的调节、记忆与学习的形成、情绪反应、药物成瘾及戒断等方面［8］。研究发现，CREB参与了ARDS的发病过程，肺部炎症反应后中性粒细胞介导的细胞凋亡可能是ARDS的发病机制之一，转录因子CREB参与了上述过程［9］。在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中，CREB通过调节细胞毒T淋巴细胞相关抗原4的表达发挥抗炎作用，同时在体外培养的EL4细胞（小鼠淋巴瘤细胞）和CD4＋T细胞中得到同样的结果［10］。由此可见，CREB通过多种机制参与了ARDS发病过程。

p-CREB是CREB发挥功能的活性形式。既往研究证实：p-CREB经多种途径参与组织的炎症反应［3，11］，在已分化的多巴胺神经元细胞中，CREB磷酸化能增加细胞对TNF-α诱导的炎症反应的抵抗作用［4］。研究发现基因敲除CREB基因后，正常和炎性损伤的内皮细胞通透性均明显增加。与正常组大鼠相比，CREB基因敲除大鼠对炎症诱导的肺水肿恢复缓慢［12］，提示CREB在维持肺血管功能上起重要作用。

本实验首先复制RPMVEC单层损伤模型，发现LPS刺激RPMVEC后，CREB中Ser133位点磷酸化水平随着LPS刺激浓度的增加而逐渐升高，且在30 min时达到峰值，表明LPS能快速诱导RPMVEC中CREB磷酸化。加入PKA通路特异性抑制剂V5681，预孵育RPMVEC后，LPS诱导的CREB磷酸化几乎被完全抑制，这表明PKA通路介导了LPS诱导的CREB磷酸化。与LPS单独刺激相比，加入V5681预处理后，RPMVEC单层通透性增加。提示CREB磷酸化在LPS致RPMVEC炎症损伤过程中可能起保护作用。既往研究表明，气道平滑肌细胞在炎症反应时MAPK磷酸酶-1表达明显升高，这作为一种负反馈机制限制MAPK通路介导的炎症反应，而MAPK磷酸酶-1是CREB的靶基因，在炎症介质诱导MAPK磷酸酶-1表达上调过程中，cAMP/PKA/CREB通路参与了该过程［3］；血红素加氧酶-1是血红素降解过程中限速酶，它具有抗炎抗氧化作用，在人脐静脉内皮细胞系中，炎症介质能经PKA、PKC等多种信号通路活化CREB，诱导血红素加氧酶-1表达，从而限制炎症反应和组织损伤［11］。证实炎症介质经一系列的信号通路使CREB磷酸化，活化后的CREB通过调控下游的靶基因表达限制炎症反应是CREB起保护作用的机制。

本实验证实LPS能快速诱导RPMVEC中CREB磷酸化，PKA通路介导了该过程；CREB磷酸化在LPS诱导的RPMVEC炎症损伤中可能起保护作用。期待在今后的实验中研究CREB基因敲除对PKA、PKC等蛋白激酶的反馈调节机制，针对其作用环节，采取干预措施改变细胞内信号转导，以期减轻炎症诱导的RPMVEC损伤。

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