刺梨高效液相色谱指纹图谱研究*

周欣，陈华国，张明，杨世林

(贵州师范大学天然药物质量控制研究中心、贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵阳 550001)

·药物制剂与药品质量控制·

刺梨高效液相色谱指纹图谱研究*

周欣，陈华国，张明，杨世林

(贵州师范大学天然药物质量控制研究中心、贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵阳 550001)

目的 建立刺梨的高效液相色谱(HPLC)特征图谱测定方法。方法采用反相高效液相色谱法,Hanbon Phecda C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速1 mL·min-1,检测波长255 nm,柱温:25℃;测定了14批刺梨药材的指纹图谱,应用相似度分析和聚类分析方法对药材进行分类,建立指纹图谱共有模式。结果建立了刺梨药材的指纹图谱测定方法及其特征图谱,不同产地药材图谱具有一定差异性。结论刺梨HPLC特征图谱的建立为药材质量控制提供了科学依据。

刺梨；色谱法,高效液相；特征图谱

刺梨(Rosa roχbughiiTratt.)为蔷薇科植物缫丝花的果实,晒干后入药,是贵州苗族特色药材,也是“药食两用”资源,药用价值较高,作为原料药已被广泛用于民间验方、医院制剂、中成药、保健食品的配方［1-2］。目前以刺梨为主要原料生产的中成药有血脂平胶囊、小儿消食开胃颗粒、康艾扶正胶囊等。同时,刺梨具有较好的抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、排铅镉等作用［3-5］,以其为主要原料开发出的刺梨饮料、刺梨茶、强化超氧化物歧化酶刺梨汁等一系列保健食品已经成功上市。但是,通过查阅文献发现,刺梨药材质量控制方面的研究基础非常薄弱［6］,仅《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)中以薄层来鉴别刺梨药材［7］,质量控制水平不高,不能有效控制刺梨药材的质量,无法满足刺梨药材发展应用之需要。因此,笔者采用高效液相色谱(HPLC)法对刺梨药材进行指纹图谱研究［8-10］,建立其指纹图谱测定方法,并通过数量统计分析,建立刺梨的HPLC特征图谱,用以控制刺梨药材的质量,为刺梨药材的品质评价提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪(美国Dionex公司),HH-S4型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司),TD5M低速多管架自动平衡离心机(济南博鑫生物技术有限公司),KQ-250B型超声波清洁器(昆山市超声仪器有限公司),XS105DU型十万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］。

1.2 试药 乙腈(TEDIA Company Inc.)为色谱纯,磷酸为优质纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。没食子酸对照品(批号:110831-200803)由中国食品药品检定研究院提供,原儿茶酸对照品(批号:GZDD-0773-201201)由贵州迪大科技有限责任公司提供。刺梨药材经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为Rosa roχbughiiTratt.的果实,样品来源及采集信息见表1。

表1 刺梨药材采集信息Tab.1 Harvest information of Rosa roxbughii Tratt.

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Hanbon Phecda C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相为A:乙腈,B: 0.05%磷酸溶液,梯度洗脱,洗脱程序见表2。检测波长:255 nm；柱温:25℃；流速:1 mL·min-1。

表2 洗脱程序Tab.2 Elution program %

2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、原儿茶酸适量,用甲醇配制成浓度分别为18.6,37.5μg·mL-1混合对照品溶液。

2.3 样品溶液制备 称取刺梨药材粉末(过孔径0.250 mm药筛)1.0 g,置于150 m L具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇溶液20 mL,称质量,回流提取2 h后,补质量,摇匀,滤过,滤液转移至50 mL的离心管中,离心(4 000 r·min-1)5 min,取10 mL上清液,挥干,用水20 mL分散,转移至分液漏斗中,用水饱和正丁醇溶剂萃取3次,每次20 mL,用正丁醇饱和的水20 mL洗脱萃取液3次,蒸干正丁醇溶液,用甲醇定容于10 mL量瓶中,摇匀,过孔径0.45μm微孔滤膜,即得。

2.4 测定方法 精密量取上述混合对照品溶液和样品溶液各10μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验 精密称取刺梨药材粉末1 g,按照“2.3”项下方法制备样品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进行操作,连续进样6次,以84 min色谱峰为参照,计算其相对保留时间的RSD为0.3%,相对峰面积的RSD为0.6%,表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性实验 取同批刺梨药材(贵阳市息烽县永靖镇)粉末6份,按“2.3”项下方法制备样品溶液,考察色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。以84 min色谱峰为参照,计算得知,相对保留时间的RSD均<0.9%,相对峰面积的RSD均<1.7%,表明重复性良好。

2.5.3 稳定性实验 精密称取刺梨药材(贵阳市息烽县永靖镇)粉末1.0 g,按照“2.3”项方法制备样品溶液,按“2.1”项下色谱条件,分别在0,4,8,24,36, 48 h进样,每次进样10μL,以84 min色谱峰为参照,计算得知,色谱峰相对保留时间的RSD均<0.7%,相对峰面积的RSD均<1.8%,表明样品溶液在48 h内稳定。

2.6 贵州地区刺梨药材HPLC指纹图谱指纹的建立 精密称取刺梨药材粉末1.0 g,按照“2.3”项方法制备样品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”,进行分析,参数设置:(a)参照图谱:采用1号样品作为相似度计算时校正的参照图谱；(b)时间窗宽度:0.10；(c)校正方式:多点校正。校正色谱峰的确定:本品色谱图中主要色谱峰在0～120 min内基本分布均匀,为保证不同批次指纹图谱匹配时校正准确性,选择了15个点进行校正Mark峰,其中包括没食子酸和原儿茶酸。(d)14批刺梨药材色谱图生成指纹图谱见图1,共有模式图谱见图2,相似度计算结果见表3。

2.7 聚类分析 利用SPSS18.0版软件对14批不同产地的刺梨药材进行聚类分析,将14个样品的20个共有峰面积作为特征,采用离差平方和法,以欧氏距离对样品聚类,聚类分析树状图见图3。

图1 14批刺梨药材指纹图谱叠加图Fig.1 Overlap figure of fingerprint for 14 batches of Rosa roxbughii Tratt.

图2 刺梨指纹图谱共有模式及特征峰指认1.没食子酸;2.原儿茶酸Fig.2 Common pattern and unique peak of fingerprint of Rosa roxbughii Tratt.1.gallic acid;2.protocatechuic acid

表3 14批刺梨样品的相似度结果Tab.3 Sim ilarity results of 14 batches of Rosa roxbughii Tratt.of sam p les

结果显示:14个样品中,样品被分成A、B两大类,各自又分为A1、A2、B1、B2四大类。阈值=4时,可分为五类:第一类包括12,13,14号药材；第二类包括1, 5,8号药材；第三类包括3,6,7,9,11号药材；第四类包括2号药材；第五类包括4号药材。其中,A类药材主要集中分布于贵州省中部及北部地区,B类药材主要集中分布于贵州省西部地区的毕节和六盘水。

图3 聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 实验过程中,对甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、无水乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇等溶剂进行了考察,结果表明,不同溶剂提取物的HPLC图谱在指定的色谱分析条件下检视,记录色谱图,比较各溶剂提取得到的色谱峰数量及峰面积大小,结果表明提取溶剂极性对提取效果影响较大,50%乙醇提取效果较好,选用其作为提取溶剂。

3.2 溶剂用量 分别考察了20,40,60 mL溶剂对图谱的影响,研究结果显示,随着提取溶剂量的增加对药材提取效率无显著影响,故提取溶剂用量选择20 mL。

3.3 提取温度 分别考察了60,70,80,90℃水浴下回流提取,研究结果显示,随着提取温度的升高,色谱图的数量及峰面积有所增加,但当温度为90℃时,有部分成分分解,所以采用提80℃水浴提取。

3.4 提取时间 分别考察了提取0.5,1.0,1.5,2.0, 2.5 h对图谱的影响,结果显示,提取时间由0.5 h变为2 h,主要峰峰面积增加不大,再延长到2.5 h时,主要峰的峰面积有降低的趋势,可能的原因是化合物被分解,所以选择2 h作为提取时间。

3.5 提取次数 分别考察了提取1,2,3次对图谱的影响,结果显示,提取2次与提取1次的效率差异不大,提取次数再次增加,峰面积几乎无变化,故选择提取1次。

3.6 萃取方法 由于刺梨果实的产地、采收期、存放时间不同,药材中糖类、有机酸等大极性物质的含量差异较大,响应值较高,影响图谱整体效应,所以采用萃取去除大极性的物质。实验过程中以乙酸乙酯、正丁醇作为萃取溶剂,方法1:取回流提取液10 m L,蒸干后,用水20 mL分散,每次用乙酸乙酯25 mL提取、萃取2次,合并萃取溶剂,蒸干后,用甲醇溶液定容到10 m L量瓶中,混匀,微孔滤膜过滤,进样；方法2:采用水饱和正丁醇萃取,其余条件同方法1；方法3:将方法2得到水饱和正丁醇萃取液转移至分液漏斗,每次用正丁醇饱和的水20 m L进行洗脱,洗脱3次后的正丁醇萃取液,按上述方法进行操作；方法4:用正丁醇饱和的水20 mL进行洗脱2次,其余部分均按方法3操作。研究结果显示,与未萃取样品色谱图比较,各方法所得到的图谱,除方法3前段大极性物质色谱峰较小之外,后部分的峰个数及峰面积差异较小,故选择方法3作为萃取方法。

3.7 色谱柱 共考察了4根不同的色谱柱,分别为: Hanbon Phecda C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、Hanbon Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A(250 mm×4.6 mm,4μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)。在选定的相同色谱条件下进行测定,结果显示,Hanbon Phecda C18柱的分离效果最好,柱效较高,故选择Hanbon Phecda C18柱进行刺梨指纹图谱的检测。

3.8 色谱流动相 实验过程中,对乙腈-水、乙腈-水(0.2%甲酸)、乙腈-水(0.2%醋酸)、乙腈-水(0.05%磷酸)、甲醇-水(0.5%磷酸)四组流动相系统进行筛选,结果表明,不同流动相中,以乙腈-水(甲酸)的梯度洗脱系统效果最佳,色谱图上各个色谱峰的分离度良好,基线最稳,保留时间适中。

3.9 检测波长 利用DAD二极管阵列检测器进行全波长扫描,兼顾到所有色谱峰的吸收值,故选择255 nm作为刺梨HPLC指纹图谱的检测波长,该检测波长下出峰较多,反映的信息较完全；各个峰吸收值良好,基线平稳,也避免了近紫外杂质峰的影响。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.024

Study on HPLC Fingerp rint of Rosa Roxbughii Tratt.

ZHOU Xin,CHEN Hua-guo,ZHANG Ming,YANG Shi-lin
(The Research Center for Quality Control of Natural Medicine,Guizhou Normal University,Key Laboratory for Information System of Mountainous Areasand Protection of Ecological Environment,Guizhou Province,Guiyang 550001,China)

Objective To establish an HPLCmethod for determining fingerprint ofRosa roχbughii.MethodsThe HPLCmethod was used with Hanbon Phecda C18column(250 mm×4.6 mm,5μm).Themobile phase consists of acetonitrile (A)and 0.05%phosphoric acid(B)with a gradient elution.The column temperature was set at 25℃,and the detective wavelength was 255 nm.The HPLC fingerprint for 14 batches ofRosa roχbughiiwas studied.The similarity analysis and cluster analysiswere taken to classify the herbs and establish a common pattern of fingerprints.ResultsA HPLC method for determination of ingredients inRosa roχburghiitratt and the fingerprintwere established.A unique fingerprintwas presented for herbs from different areas.ConclusionThe establishment of HPLC feature fingerprint ofRosa roχburghiiTratt provides scientific basis for herbs quality control.

Rosa roχbughiiTratt;Chromatography,high performance liquid;Feature fingerprint

R282.71;R284

A

1004-0781(2014)01-0082-04

2013-04-03

2013-05-21

*“十二五”国家科技支撑计划(2011BAC09B01)；贵州省国际合作项目(黔科合外G［2012］7024号)；贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合人才团队(2011)4008)；贵州省教育厅特色重点实验室项目(黔科合KY［2012］005号)；贵阳市科技重大专项项目(筑科合同［2012401］社-4号)

周欣(1962-),女,贵州贵阳人,教授,博士,研究方向:中药、民族药质量控制、中药指纹图谱以及中药新药研发。电话：0851-6700414,E-mail：alice9800@sina.com。