氨氮浓度对CANON工艺性能及微生物特性的影响

张肖静,李 冬,梁瑜海,何永平,张玉龙,范 丹,张 杰*(.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 50090；.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京 004)

氨氮浓度对CANON工艺性能及微生物特性的影响

张肖静1,李 冬2,梁瑜海2,何永平2,张玉龙2,范 丹2,张 杰1*(1.哈尔滨工业大学市政环境工程学院,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090；2.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京 100124)

为了考察氨氮浓度对CANON反应器启动过程、运行性能及微生物特性的影响,在2个相同的常温MBR反应器内同时接种取自城市污水厂的普通活性污泥,在限氧条件下启动CANON工艺.其中R1进水氨氮保持80mg/L不变,通过逐渐减小HRT启动,R2则保持HRT不变,通过逐渐增加进水氨氮启动.启动成功后,2个反应器分别在不同氨氮浓度下稳定运行相同时间后,取泥样做扫描电镜观察反应器内微生物形态.同时采用克隆-测序分析技术对2个反应器内全细菌进行16S rRNA分析,鉴定反应器内功能微生物种属.结果表明,R1和R2的启动时间分别为78,50d.TN去除负荷分别达到0.9,0.7kg/(m3·d)以上.反应速率测定结果表明,高氨氮运行的反应器内亚硝化菌和厌氧氨氧化菌具有较高的活性,NOB被抑制或淘洗的较为彻底.SEM及克隆测序结果表明,2个反应器中的功能微生物均为亚硝化单胞菌和待定斯图加特库氏菌,R1中存在少量硝化杆菌,而R2中几乎检测不到硝化菌.因此,高氨氮下运行的反应器具有更高的活性及稳定性.

CANON；氨氮；MBR；HRT；DO

近年来低C/N废水的排放量越来越多,同时一部分废水有机碳源被转化为生物能源利用,从而导致传统脱氮工艺-硝化反硝化所需碳源不足,进而限制了脱氮效率[1].全程自养脱氮工艺(CANON)是近年发展起来的新型脱氮工艺,该工艺可利用好氧氨氧化细菌(AerAOB)和厌氧氨氧化菌(AnAOB),在不消耗有机碳源的条件下实现脱氮,同时可节省63%的曝气量,被认为是最经济有效的脱氮途径[2-4].目前CANON工艺已经在一些高温高氨氮废水中得到成功应用,但是常温低氨氮废水中的应用还存在启动时间长及去除负荷低等问题[5-6],这是因为低氨氮不利于AerAOB和AnAOB的生长及对NOB的抑制.因此,比较不同氨氮下 CANON反应器的启动过程及运行效果,确定氨氮浓度对反应器运行的影响,将有利于该工艺在低氨氮废水中的应用,从而推动该工艺的发展.另一方面,CANON工艺的高效稳定运行基于AerAOB和AnAOB的协同作用,氨氮作为两种功能微生物的重要基质,其浓度不仅影响工艺的效能及稳定性,同时对反应器内微生物种群特征也有影响,而目前关于不同氨氮下微生物形态及种群特征的比较研究还较少.

MBR反应器可以将所有微生物截留在反应器内,达到较高的生物浓度[7],使反应器的去除负荷得到提高,并且适于长泥龄微生物例如AerAOB和AnAOB的生长[8-9].因此,本试验在2个相同的 MBR反应器内,分别采用较低氨氮(80mg/L)和较高氨氮(200mg/L)两种进水启动CANON工艺,比较了启动时间及去除效果,以及3种功能微生物的活性.同时,利用扫描电镜(SEM)及克隆-测序技术分析了2个反应器内的微生物形态及功能微生物的种群特征.

1 材料与方法

1.1 反应器设置

试验中采用 2个设置完全相同的圆柱形MBR反应器(图1),分别记为R1和R2.反应器材料为有机玻璃,有效容积分别为5.5L和13.2L.反应器内部放置聚偏氟乙烯中空纤维膜组件(厦门,鲲扬),膜孔径0.1µm,有效面积0.2m2.反应器置于直径为70cm的水浴中,保证恒温25℃运行.

1.2 接种污泥及废水

接种污泥取自以A2/O工艺运行的北京高碑店污水处理厂的回流污泥(12.9g/L),分别接入R1和R2.进水采用人工配水,以(NH4)2SO4为主要基质,投加NaHCO3保证以CaCO3计的碱度与氨氮的浓度比为 8左右,并添加 KH2PO4(0.136g/L), MgSO4·H2O(0.3g/L),CaCl2(0.3g/L)及微量元素[10](1mL/L).2个反应器的运行均包括2个阶段,在第1阶段,采用逐渐增加进水氨氮负荷(ALR)的方式抑制NOB并富集AerAOB,其中R1进水氨氮保持 80mg/L不变,逐渐缩短水力停留时间(HRT) (8→5→3.5→2.4h),R2保持HRT为6.5h,进水氨氮逐渐增加(70→100→150→200mg/L),DO 均为0.2mg/L以下.第2阶段,R1和R2的DO均降为0.1mg/L左右,启动CANON工艺.启动成功后,R1在进水氨氮为80mg/L,HRT为1.9h的条件下运行,R2在进水氨氮为200mg/L,HRT为6.5h的条件下运行.试验期间污泥龄为 100d,反应温度25℃,2个反应器的 pH均没有刻意控制,维持在7.6左右.

图1 MBR反应器示意Fig.1 Schematic diagram of MBR

1.3 化学分析方法及反应速率的测定

NH4+-N:纳氏试剂分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:紫外分光光度法;碱度: ZDJ-2D电位滴定仪;DO、pH、T:WTW多电极便携式测定仪.

反应速率的测定:在试验的第 170～180d,从稳定运行的R1和R2各取出1L混合液,放入2个1L的烧杯内,底部放置曝气环,设机械搅拌.分别测定CANON反应速率、Anammox反应速率及硝化反应速率,用来表征AerAOB和AnAOB的协同活性、AnAOB的活性以及NOB的活性.测定3种速率时,烧杯内温度均为25℃,碱度为进水总氮的10倍,pH为7.6左右,内置膜组件,膜出水回流至烧杯内.每隔 1h取出水测定三氮,待出水中三氮浓度不再发生变化时停止反应.测定CANON反应速率时,进水只配氨氮(135mg/L),曝气量0.2L/min.测定Anammox速率时,进水配亚氮(75mg/L)与氨氮(60mg/L),不曝气.测定硝化反应速率时,进水只配亚氮(135mg/L),曝气量0.2L/min.CANON和Anammox反应速率按式(1)计算,硝化反应速率按式(2)计算:

1.4 SEM及微生物群落分析方法

在第178d从2个反应器内分别取出混合液10mL, 5000r/min离心去上清.SEM 的检测方法为:在沉淀中加入2.5%的戊二醛5mL,置于4℃冰箱中固定4h;用0.1mol/L,pH 8.0的磷酸缓冲溶液冲洗 3次,每次 10min;分别用浓度为 30%,50%, 70%,90%的乙醇进行脱水,每次15min,再用100%的乙醇脱水3次,每次15min;然后加入100%乙醇:乙酸异戊酯=1:1 的混合液及纯乙酸异戊酯各一次进行置换,每次15min;对样品真空干燥后,喷金,通过扫描电镜(HITACHIS-4300)观察污泥形态.

微生物群落特征分析的方法为:在2个反应器均实现稳定的CANON工艺后, 同时从2个反应器中取泥样进行分析.首先采用上海生工的DNA抽提试剂盒对泥样的基因组DNA进行提取,提取后以 0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检验.之后对提取的基因组 DNA进行全细菌 16S rRNA的 PCR扩增,扩增引物采用通用引物对27f(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492r(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’).扩增程序为:98℃预变性1.5min;25个循环:98℃, 10s,55℃,45s,72℃,80s;72℃,7min. PCR产物利用PCR纯化试剂盒(上海生工)纯化之后,采用PMD19-T载体系统进行克隆(日本, TaKaRa).从2个反应器的克隆平板分别挑取同等数量的克隆子进行过夜培养后送至上海生工公司测序,测序得到的与脱氮有关的微生物序列在与已有文献进行BLAST比对后,提交至Genbank基因库,授权序列号为KJ023567- KJ023576.

2 结果与讨论

2.1 反应器的启动

亚氮积累是 CANON工艺启动的关键步骤

[11].实现亚氮积累一方面需要对 NOB的有效抑制或彻底淘洗,另一方面需要实现AerAOB的富集,从而将氨氮的氧化停留在亚氮阶段,为后续厌氧氨氧化反应提供基质.考虑到高 ALR及低DO对NOB的抑制作用[12],将2个反应器的DO均控制在0.2mg/L以下,分别通过减小HRT和增加进水氨氮增大ALR.如图2所示,在R1中, HRT在第25d降为3.5h,ALR增加为0.5kg/(m3·d),反应器中出现亚氮积累,亚氮积累率(NAR)逐渐升高.说明此时 NOB的活性受到抑制,不能将亚氮完全转化为硝氮,从而造成了亚氮的积累.然而,NAR在上升到 60%左右之后不再升高,并有下降的趋势,这说明 NOB的活性没有被完全抑制,逐渐适应该反应条件,活性得到一定程度的恢复.而在 R2中(图 3),第 24d进水氨氮增至200mg/L后,经过3d的迟缓期,第27d亚氮开始积累,在15d之内升高到90%以上.此时R2的ALR为0.75kg/(m3·d)左右,为了验证ALR对抑制NOB的有效性,在第40d将R1中的HRT降至2.4h,使其ALR达到0.7kg/(m3·d)以上,NAR第2次迅速上升,最终稳定在99%以上.这一阶段的结果说明控制ALR为0.7kg/(m3·d)以上对抑制NOB,启动亚硝化是有效的.该方法既可通过改变进水氨氮浓度又可通过改变流量来实现,简单易于操作,可以在30d以内启动亚硝化.

R1和R2均实现稳定的亚氮积累后,将2个反应器内DO再次降低,其他条件均不变,设定总氮去除负荷(NRR)达到 0.1kg/(m3·d)时,认为CANON工艺启动成功.由图3可知,R2在第50d表现出总氮去除的能力,NRR逐渐增大.而R1一直没有总氮去除,因此在第67d进一步降低HRT为1.9h提高ALR,在第78d时NRR达到0.1kg/ (m3·d)以上,实现了启动.R1和 R2的启动时间分别为 78,50d,R2启动时间较短,分析原因是较高的进水氨氮对抑制 NOB更有效,同时更有利于诱导AnAOB的活性,因此R2更早的表现出自养脱氮能力.本试验中常温接种普通活性污泥,分别在78,50d之内成功启动CANON工艺.之前的研究中大多是接种厌氧氨氧化污泥或 CANON污泥,或者在较高温度下启动,启动时间多在 100d以上[13-14].因此,本文提出的在限氧条件下缩短HRT和增加进水氨氮浓度的两种启动策略均是可行的,这2种方法均无需加温,对工程应用来说更有意义. 最终,R1的TN去除负荷达到0.9kg/ (m3·d)以上,R2达到0.70kg/(m3·d)以上.

图2 低基质CANON反应器的启动及稳定运行Fig.2 Performance of the CANON reactor with low substrate during the experiment

图3 高基质CANON反应器的启动及稳定运行Fig.3 Performance of the CANON reactor with high substrate during the experiment

2.2 功能微生物的活性比较

为了比较2个反应器中功能微生物AerAOB和AnAOB的活性以及NOB被抑制的程度,分别测定了CANON反应速率、Anammox反应速率以及硝化反应速率.结果表明,在进水水质及反应条件均一致的条件下,R2反应器内的CANON反应速率和 Anammox反应速率均高于 R1.R1的CANON反应速率和Anammox反应速率分别为4.5,9.7mg/(h·gMLSS),而 R2分别为 5.1,11.1mg/ (h·gMLSS)(图 4).这说明 R2中 AerAOB和AnAOB的活性均比R1反应器内的要高,在单位时间内单位生物量所去除的总氮较多.与之相反的是,R1和 R2的硝化反应速率均较低,分别为1.3,0.5mg/(h·gMLSS),这说明 2个反应器在实现稳定的CANON工艺后,NOB已经不是反应器内的优势菌种,被淘洗的较为彻底,AerAOB和AnAOB成为反应器的优势菌种.然而,R1的硝化反应速率较高于R2,说明R1中残留的NOB数量多于R2,或者R1中NOB的活性较高.因此,高氨氮更有利于反应器的稳定运行.同时,高氨氮运行下的反应器中AerAOB和AnAOB的活性较高.

图4 2个反应器的反应速率比较Fig.4 Comparisons of the reaction rates between the two MBR-CANON reactors

虽然R2的AerAOB和AnAOB的活性较高,但在相同的时间内,R1所达到的TN去除负荷更大.同时,R1中得到了较高的污泥浓度(MLSS),稳定运行阶段平均MLSS为6.0g/L左右,而R2为4.0g/L左右.因此推测R1中较高的TN去除负荷是由于较高的生物浓度造成.在较短的 HRT下,较大的进水流量使污泥与基质的接触更为充分,进水负荷也较高,因此污泥生长较快,从而导致了较高的负荷.一般认为,HRT越短,越容易导致污泥的流失,从而造成 MLSS较低,然而这是基于普通活性污泥法而言的.在MBR系统中,所有的微生物均被截留在反应器内,较大的进水流量不会导致污泥流失,保证了较高的 MLSS,从而实现了较高的总氮去除.因此,在进水基质较低时,可以选择较短的HRT来实现高去除负荷.

2.3 微生物形态分析

2个反应器在实现稳定的CANON工艺后,反应器内污泥颜色均变为红色,这是同时包含AerAOB和AnAOB的CANON污泥独特的颜色特征[10].比较R1和R2扫描电镜结果(图5),发现R1内污泥的特点是包含长杆状、短杆状及球形菌,而 R2内均为短杆状和球形菌,几乎不存在长杆状微生物,同时 R2内球形菌分布更为密集,推测原因是较低的流量使得反应器微生物更趋于成簇生长.

污水处理中经常出现的 AerAOB主要是亚硝化球菌属(Nitrosococcus)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas),其形态分别呈球状和短杆状,而NOB主要是硝化螺菌属(Nitrospira)和硝化杆菌属(Nitrobacter),形态分别呈螺旋状和杆状[15].2个反应器均未检测到螺旋状细菌,说明反应器内不存在硝化螺菌属,这与前人的研究中认为CANON反应器对硝化杆菌具有优先选择性的结论一致[16].厌氧氨氧化菌为规则或者不规则的球形和椭球形,单生或成簇聚生[17-18],直径约0.8～1.1µm.因此,图 5中的球形菌可能为Nitrosococcus和厌氧氨氧化菌,短杆菌可能为Nitrosomonas,而长杆菌可能为硝化杆菌属Nitrobacter.同时结合前人研究中认为 CANON反应器不利于Nitrosococcus生存[19],因此推测图中球形菌为厌氧氨氧化菌.因此可知,R1和R2中均含有AerAOB和AnAOB,同时R1中含少量NOB,而R2中由于NOB数量极少而没有检测出来.这与活性测定中显示 R1中硝化反应速率较高的结果是一致的.

图5 不同基质反应器内污泥样品的电镜照片Fig.5 SEM results of the two reactors

2.4 功能微生物种群特征

为了分析稳定运行的2个CANON反应器中的微生物种群特征,对反应器内全细菌进行基因组DNA克隆测序分析,结果如表1所示.从测序结果可看到,在等量的克隆子中,R1反应器共检测出3个AerAOB和1个AnAOB序列.而R2反应器中共检测出5个AerAOB和1个AnAOB序列.这个结果在一定程度上说明 R2中 AerAOB在活性污泥中所占的比例高于R1,因此检测出较多的有效序列.这与2.2中R2的CANON反应速率较高的测定结果是一致的,较多的功能微生物比例导致了较高的反应速率. R1的3个AerAOB序列均与Nitrisomonas sp.有较高的相似度,这说明在 R1中该种微生物占据绝对的优势,功能微生物的多样性较差,群落构成较为稳定.而在 R2中,有3个序列属于Nitrisomonas sp.,另外2个序列分别为Nitrosomonas europaea和Nitrosomonaseutropha.这说明R2反应器中AerAOB不仅数量较多,同时具有较高的生物多样性,这可能是由于较高的氨氮浓度造成的.氨氮作为AerAOB的唯一基质,较高的氨氮浓度扩展了其生态幅,使能够生存的AerAOB种群增多,因此造成了较高的生物多样性.2个反应器中均只检测到一个AnAOB序列,均属于Candidatus Kuenenia stuttgartiensis.这说明氨氮浓度的变化对 AnAOB种群的影响不大,反应器的设置相比反应条件来说对AnAOB的选择性更为明显,这与之前文献报导的研究结论是一致的[11].此外,有研究认为[20], Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas eutropha均具有厌氧氨氧化能力,因此,这两种微生物在R2中也承担了一定的脱氮任务.

表1 基因组DNA克隆测序结果

值得注意的是,2个反应器中均没有检测到NOB序列,这说明在稳定运行的CANON反应器中,NOB已经不占优势,甚至被完全淘洗出反应器.虽然反应速率测定及SEM结果均显示R1中存在微量NOB,但是由于克隆测序的方法只能检测到在泥样中数量较占优势的微生物种群,因此数量极少的 NOB序列难以被扩增出来,这也从另一方面说明了 NOB的数量极少.微生物种群分析结果表明,较高氨氮的反应器内生物多样性较高,2个反应器中的主要功能微生物均为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和待定斯图加特库氏菌(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis),这与之前的研究结果是一致的[21].这两种微生物在反应器内协同作用,完成了高效自养脱氮.

3 结论

3.1 在常温MBR反应器中,控制进水氨氮负荷为 0.7kg/(m3·d)以上,可以有效抑制 NOB,实现亚硝化.在限氧条件下减小HRT和增大进水氨氮均可实现 CANON工艺的启动,启动时间分别为78,50d.

3.2 高氨氮运行的反应器内 AerAOB 和AnAOB活性均高于低氨氮运行的反应器,同时对 NOB的淘洗更为彻底,因而稳定性更高.低氨氮反应器由于其较短的HRT实现了较高的污泥浓度,从而达到了较高的TN去除负荷.

3.3 克隆测序结果表明,高氨氮反应器内生物多样性较高,2个反应器中的功能微生物均为Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis,两种微生物共同完成了高效自养脱氮.

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《中国环境科学》获评“2012中国最具国际影响力学术期刊”

2012年12月,《中国环境科学》被评为“2012中国最具国际影响力学术期刊”.

“中国最具国际影响力学术期刊”是中国科学文献计量研究中心、清华大学图书馆依据《CAJ国际引证报告》,按2011年度中国学术期刊被SCI期刊、SSCI期刊引用的总被引频次排序并经40多位期刊界专家审议,遴选出的TOP5%期刊.获评“中国最具国际影响力学术期刊”的科技类期刊共156种.统计分析结果表明,从定量分析的角度看,“中国最具国际影响力学术期刊”的国际影响力已经达到国际中等以上水平,跨入了国际品牌学术期刊行列.

《中国环境科学》编辑部

Effect of ammonia concentration on the performance and microbial characteristics of CANON process.

ZHANG

Xiao-jing1, LI Dong2, LIANG Yu-hai2, HE Yong-ping2, ZHANG Yu-long2, FAN Dan2, ZHANG Jie1*(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China). China Environmental Science, 2014,34(7)：1715～1721

In order to study the influence of ammonia concentration on CANON process, conventional activated sludge was seeded to two identical MBR at ambient temperature, which were named R1 and R2, respectively. Under oxygen-limited condition, R1 was started-up by decreasing HRT, while R2 was started-up by increasing influent ammonia concentration. Then R1 and R2 were fed with ammonia of 80and 200mg/L, respectively. SEM and clone-sequencing were used to analyze the morphology and microbial community of the functional bacteria. The start-up period of R1 and R2 were 78 and 50d, and the NRR were 0.9 and 0.7kg/(m3·d), respectively. The bioactivity of AerAOB and AnAOB in the reactor fed with high ammonia was higher than that of the reactor with low ammonia, while that of NOB showed a contrary result. Results of SEM and clone-sequencing indicated that Nitrosomonas and Candidatus Kuenenia stuttgartiensis predominated in the two reactors, and a small amount of Nitrobacter existed in R1. Thus, the reactor fed with high ammonia performed a stronger stability.

CANON；ammonia nitrogen；MBR；HRT；DO

X703.1

A

1000-6923(2014)07-1715-07

张肖静(1986-),女,河南开封人,哈尔滨工业大学博士研究生,主要研究方向为废水自养脱氮.

2013-09-26

国家自然科学基金(51222807);国家重大科技专项水专项(2012ZX07202-005);城市水资源与水环境国家重点实验室开放基金(QAK201005).

* 责任作者, 中国工程院院士, hitzhangjie@163.com