鸡滑液囊支原体的分离鉴定及耐药性分析

顾的乐

（新兴县温氏食品联营有限公司，广东 云浮 527400）

由鸡滑液支原体（Mycoplasma Synoviae，MS）引起的腿病是鸡的一种常见、多发性传染病。该病在规模化鸡场中分布广泛、危害大，主要引起4～16周龄的鸡感染发病，并迅速水平传播，鸡群发感染后发育受阻，甚至引发免疫抑制，容易继发或伴发其它疫病。近年来，由于环境因素或鸡群不良状态等不利因素的影响，该病在免疫鸡群中的爆发现象日趋严重，对鸡业养殖生产中控制及预防带来严峻的考验。因此，本研究应用实验室方法分离广东地区疑似MS病原，利用PCR技术、观察菌落形态、病例复制等方法对病原进行鉴定，并对MS分离株进行敏感药物的筛选，为临床有效防控该病提供较为可靠的参考。

一、材料与方法

1 材料

1-1 病料：收集广东某地区疑患MS感染鸡群的气管、支气管、肺、腿关节等组织和分泌物。

1-2 鸡胚：鸡胚 9日龄健康鸡胚。

1-3 实验动物： 10日龄SPF鸡。

1-4 试剂： PCR扩增试剂盒购自国外某公司；其它试剂为国内生产的分析纯试剂。

1-5 引物设计与合成利用Primer Premier5.0软件，根据Genbank中注册的MS 16SrRNA片段基因序列，设计合成多对引物，经过反复筛选出一对特异性引物MS-F/MS-R（MS-F：5’-CAGGCCGTCAAGGTCTTGTTC--3’；MSR2：5’- ACCGGCACAGCTATCCTCCTT-3’），跨度500bp。引物由国内一公司合成，引物使用终浓度为20nmoles/mL，-20℃状态保存。

2 方法

2-1 鸡滑液囊支原体的分离和鉴定

2-1-1 样品的收集与处理

收集广东地区鸡群的疑患MS感染鸡群的气管、支气管、肺、腿关节组织和分泌物，加入MS培养基中，37℃培养数天，直至培养基变黄。

2-2 鸡毒支原体单菌落的挑取

无菌抽取少量已经变黄的培养液进行杂菌污染检查，在确定培养液无杂菌生长之后，将变黄可疑培养物在相同的培养基中连续传代3～5 代，然后取0.2mL培养物，接种于支原体固体培养基中，在37℃ 厌氧环境下培养7～15天。待肉眼可视菌落大小后，置于倒置10×10低倍显微镜下观察菌落形态，并用灭菌注射器针头挑取典型单菌落于2mL 液体培养基中，进行传代培养和鉴定。

2-3 鸡毒支原体菌落形态观察

将分离纯化培养的待鉴定的鸡毒支原体培养物0.2mL接种于固体培养基中，37℃ 厌氧培养7～10d 后，置于低倍镜下观察菌落形态。

2-4 鸡毒支原体姬姆萨染色镜检

将纯化培养后待检鸡毒支原体培养液5mL，以3000rpm离心10min,用 PBS（pH6.8）按1/20 比例稀释姬姆萨染色液，染色3h。

2-5 临床菌株的分子生物学鉴定

按照爱思进公司的DNA提取试剂盒说明书提取MS的DNA。按照PCR扩增试剂盒说明，在24.4μL反应体系中，加入 RNAfree 水 16.6μL，5×PCR buffer5μL,酶 0.2μL，cDNA2μL,P1和P2各0.3μL。扩增参数为：经过94℃ 3秒后，94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s，循环30次。再在72℃延伸10 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

图1 a临床第1株在固体培养基上培养10天后菌落（10×10）

2-6 动物回归实验

病鸡关节炎渗出物接种于18天龄SPF鸡胚卵黄囊，孵育7天后，收集卵黄液，以脚垫注射的方式按0.2ml/只用量，接种10日龄SPF鸡，每天观察并记录鸡只变化情况。

2-7 临床株对常用抗菌药物的敏感性测定

2-7-1 抗菌药原液的配制

图2

根据药物的推荐治疗量，将各抗菌药物配制成浓度为128倍治疗量的原液。氟喹诺酮类分别用无菌5%醋酸溶解后，用灭菌去离子水定容；氟苯尼考用无水乙醇溶解后，用pH6.0灭菌PBS定容；泰乐菌素用pH6.0灭菌PBS溶解、定容；强力霉素用pH4.5 灭菌PBS溶解、定容；采用细菌过滤除菌，分装，-20oC冰箱保存备用。

2-7-2 最小抑菌浓度的测定

首先测定各株临床菌的颜色变化单位（CCU），参照Hannan 推荐的标准，临用前将各菌株稀释至105。在96孔细胞板中,第1列每孔加180uL稀释的菌液，其余各管中加入100uL菌液，将20umL药液加入每列的第一孔中，充分吹打均匀后，取100uL加入第二管，以此类推，最后吸出100uL菌液弃去。每种药液做两个重复，最后两列不加抗生素作空白对照37oC培养6～10d，每日观察记录结果。以抑制MG生长的抗生素的最高稀释度作为最小抑菌浓度。

3 结果

3-1 临床鸡滑液囊支原体的分离、鉴定

3-1-1 鸡滑液囊支原体菌落形态观察

分离纯化的可疑菌株在液体培养基中生长呈清亮黄色，轻轻振荡，有沙粒样菌体悬浮。在固体培养基上培养7～10d后，有些菌株用肉眼观察，可见针尖大小、无色透明、圆润、边缘光滑的菌落。置低倍镜（10×10）下观察，可见菌落为无色透明，多数呈典型的“油煎蛋状”，即菌落中央厚硕隆起。能观察到支原体的出芽和裂殖两种增殖方式。（见图1）

3-1-2 鸡滑液囊支原体姬姆萨染色镜检

分离纯化后的鸡滑液囊支原体经姬姆萨染色后，在（100×10）显微镜下镜检，菌体主要呈现蓝紫色球状，有少量呈细短杆状或弧状。

3-1-3 分子生物学鉴定

应用所设计的引物对MS分离株的核酸进行PCR扩增，结果扩增出一条为约500bp左右的目的片断，与设计结果完全相符。（见图2）

3-1-4 动物回归试验

病鸡关节炎渗出物接种于18天龄SPF鸡胚卵黄囊，孵育7天后，收集卵黄液，以脚垫注射的方式接种10日龄SPF鸡（0.2ml/只），每天观察鸡只变化情况。接种后7天左右，鸡群出现与MS临床感染相同的典型临床症状，主要表现为卧地、陂行、关节肿胀，解剖可见鸡只关节内有黏液渗出物，部分鸡只关节内有干酪样渗出物。

3-2 抗菌药物敏感性实验结果

表1 9种抗菌药物对7株鸡滑液囊支原体的最小抑菌浓度

采用试管二倍稀释法测定了常用抗菌药物对7株鸡滑液支原体的最小抑菌浓度。结果见表1。

4 讨论

4-1 鸡滑液囊支原体感染多发于春夏季、潮湿季节或卫生条件、饲养管理不善，主要侵袭雏鸡，特别是肉雏鸡，常与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等呼吸道病原混合感染引起气囊炎，有时可引起全身性感染并导致传染性滑膜炎，给临床确诊带来巨大的困难。

目前MS感染的确诊方法主要有电镜法、分离培养法、分子生物学方法以及血清学方法；其中，血清学方法由于经常会出现非特异性的交叉反应，因而在一定程度上会影响诊断的准确性；其次，分离培养法由于支原体对所需条件要求苛刻，培养时间长并且操作也相当的繁杂。相比之下，PCR法方法显得快速简单，并且其敏感性也远远高于前两种方法，可临床应用于MS感染的早期诊断和检疫，但技术条件要求较高，在检测时常由于抑制剂的干扰等因素而可能出现假阳性反应，因此最终确诊需要多种检测方法联合使用。本研究通过菌落形态观察、菌体形态观察、PCR诊断、动物回归试验，成功建立了MS分离鉴定方法，并在病料中分离出7株MS临床株，为后续研究工作奠定了坚实的基础。

4-2 鸡支原体感染在养鸡业中非常普遍，预防和治疗该病主要应用抗菌药物，其中应用最为广泛的药物是林可霉素、泰乐菌素、红霉素、喹诺酮类和氨基糖苷类等药物，但随着临床抗菌药物的大量使用和不合理使用，导致耐药菌株的出现，造成治疗效果不佳或病情反复的现象。从本次研究的药敏结果可看出，临床株对受试的9种抗菌药物的敏感性不一，各临床株对替米考星的敏感性差异最大（4.19倍治疗量～67倍治疗量），同时，在同一地区不同时间不同养户分离的毒株对替米考星的敏感性的差异较显著，替米考星对第1分离株的最小抑菌浓度是67倍治疗量，而对第2分离株的最小抑菌浓度是4.19倍治疗量，说明不同地方的用药情况不一，同一地区不同时间不同养户的用药历史、病情长短不一，导致各临床株对同一种药物的敏感性差异较大；9种抗菌药物中，强力霉素对MS分离株的抑制效果最明显，最小抑菌浓度均小于1，其次是氧氟沙星和利高霉素，两种抗菌药物对MS的抑制效果均较为理想，因此，在临床上可尝试参考用该类药物进行防控MS感染。

[1] 鸡滑液囊支原体的分离与鉴定[J].中国家禽，1998.