HPLC荧光检测鱼肉中不确定度孔雀石绿残留量的

2014-05-10曹向英沈林辉孙文梅唐丹丹

四川畜牧兽医 2014年4期

曹向英，沈林辉，孙文梅，朱骏，唐丹丹，金立

（上海市松江区食用农产品安全监督检测中心，上海松江 201611）

测量不确定度是判定测量结果可信度的依据。根据现代计量学的观点，测量结果可信程度是需要通过分析和评定测量不确定度来确定的。本文通过数学模型，对GB/T20361-2006高效液相色谱法荧光检测鱼肉中隐性孔雀石绿残留量的不确定度进行了分析评定。

1 实验过程

1.1 仪器与试剂 Alliance 2695高效液相色谱仪-2475荧光检测器（美国Waters公司生产）；AE240分析天平（梅特勒-托利多公司生产）；T25匀浆机（德国IKA公司生产）；旋转蒸发仪（产自上海爱朗）；PRS固相萃取柱（美国Varian公司生产）；中性氧化铝小柱（博纳艾杰尔公司生产）；隐性孔雀石绿对照品由DR.公司提供，含量97%；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 样品制备称取5.0g鱼肉试样，置50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈，10000r/min匀浆提取，加入5.0g酸性氧化铝，振荡，4000r/min离心10min，上清液转移至分液漏斗，再在分液漏斗中加入2mL二甘醇和3mL硼氢化钾溶液，振摇2min；在残渣中继续加入1.5 mL盐酸羟胺溶液，2.5 mL对甲苯磺酸溶液，5.0mL乙酸铵缓冲液，10mL乙腈，振荡2min，4000r/min离心10min，上清液移入前述分液漏斗液中，再加入20mL二氯甲烷，振荡，静置分层。将下层溶液转移至鸡形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解备用。

将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端接酸性氧化铝小柱，用5mL乙腈活化。取所有待净化液过柱，再用乙腈洗鸡形瓶两次，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵洗脱，用乙腈定容至3 mL，过0.45 μm微孔滤膜，供高效液相色谱法测定。

1.3 标准品溶液的制备精密称取隐性孔雀石绿标准品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用乙腈配制成100μg/mL的标准贮备液。精密量取2.5mL贮备液，置于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，制得25 ng/mL的标准溶液。

1.4 数学模型

式中：X——样品中隐性孔雀石绿的残留量（mg/kg）；A——样品中相应隐性孔雀石绿的峰面积；As——标准溶液中相应隐性孔雀石绿的峰面积；Cs——标准溶液中相应隐性孔雀石绿的浓度（μg/mL）；V——样液最终定容体积（mL）；m——样品的质量（g）。

2 测量不确定度的来源

包括标准溶液浓度的不确定度u（Cs）；样品称样量的不确定度u（m）；试样峰面积测定的不确定度u（A）；标准溶液峰面积测定的不确定度u（As）；定容体积的不确定度u（V）；试样中添加回收率的不确定度u（R）。

3 测量不确定度的计算

3.1 标准溶液浓度的不确定度u（Cs）

3.1.1 根据标准物质证书提供的信息，隐性孔雀石绿的纯度≥97.0%，不确定度半宽a=3%，服从均匀分布不确定度为：u标物=3%/=0.0173。

3.1.2 标准品称量的不确定度。根据称量使用的电子天平检定证书，其最大允许误差为±0.05 mg，按均匀分布考虑，则标准不确定度为u（m）=0.05mg/=0.0289mg。本次称取的标样量为10.03mg，则其相对标准不确定度为：urel（m）=0.0289mg/10.03mg=2.88×10-3。

3.1.3 配制标准储备液的不确定度。按检定证书给定100mL的容量瓶最大允许误差为±0.03mL，按照矩形分布换算成标准偏差为：u＝0.03mL/=0.017mL，相对urel=0.017/100=0.00017。

充满液体至容量瓶刻度的变动性，通过重复测定进行统计，重复10次统计出标准偏差为0.12mL，从而引起的相对不确定度：urel（n）=0.12mL/100mL=0.0012。

求出此分量的合成标准不确定度：

3.1.4 标准工作液稀释过程产生的不确定度。标准工作液是由隐性孔雀石绿标准储备液稀释得到的，其质量浓度为25.00ng/mL。稀释过程中使用了一系列玻璃量具，根据JJG196-2006要求，均有相应的最大允差，按均匀分布，其相对不确定度分量如表1所示。

表1 标准液稀释过程中量具校准引起的不确定度

3.2 试样称样量的不确定度u（m）天平称量变动性的标准偏差为0.02mg；天平最大允许误差为±0.05mg，P=95%。则u＝0.05mg/＝0.029mg。求出此分量的合成标准不确定度：

本次称取的样品量为5.0g，则相对不确定度：

3.3 样品峰面积测定的不确定度u（A）加标浓度为2.0ng/mL的标准溶液，重复进样3次，测得峰面积为26868、28709、27565，平均值为 27714，极差为 1841。因测定次数较少，采用极差法n=3，C=1.64测得标准不确定度：u（A）=（28709-26868）/1.64=1122，峰面积重复测量的相对标准不确定度：

3.4 标准溶液峰面积As测定的不确定度u（As）浓度为25.0ng/mL的标准溶液，重复进样3次，测得峰面积为 545913、543619、546249，平均值为 545260，极差为2630，因测定次数较少，采用极差法，n=3，C=1.64计算得：

3.5 定容体积的相对标准不确定度urel（V）样品经萃取、净化后用5mL刻度离心管定容至3.0mL。5mL刻度离心管的容量允差为±0.1mL，按照均匀分布考虑，则定容体积的相对标准不确定度：

3.6 试样中添加回收率的不确定度u（R）实验中样品经过了乙腈-乙酸铵混合液提取、二氯甲烷液液萃取、旋转蒸发浓缩、固相萃取净化等处理过程，受固相萃取柱质量、人员操作等实验条件的影响较大，在实际中表现为回收率的偏差。

表3 回收率测定结果（添加浓度为25.0ng/mL，n=5）

3.7 合成标准不确定度的计算

3.8 扩展不确定度扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子，取置信水平95%，则k=2，试样中隐性孔雀石绿含量测定的相对扩展不确定度u=urel（X）×k=0.096。试样中隐性孔雀石绿含量的最佳估计值（X）=2.0μg/kg，故其扩展不确定度 u=2.0μg/kg×0.096=0.19μg/kg。