高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中头孢洛宁残留

2014-05-08李帅鹏郭春娜黄显会

色谱 2014年5期

李帅鹏，郭春娜，孟蕾，黄显会*

(1.华南农业大学国家兽药残留基准实验室，广东广州510642;2.河南省兽药监察所，河南郑州450008)

头孢洛宁(cefalonium)是美国先灵葆雅(Schering-Plough)制药公司在英联邦国家内开发的奶牛枯奶期针对乳房炎的预防性用药，是全球3个指定的动物专用头孢类抗生素之一，属于第二代头孢类抗生素［1］。头孢洛宁对酸和β-内酰胺酶稳定，杀菌力强，抗菌谱广，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效;尤其对引起奶牛乳房炎的大多数病原菌有效，主要用于细菌感染引起的奶牛乳房炎的防治［2－4］。目前该药只在日本、新西兰、澳大利亚、欧盟和英联邦国家范围内使用，美国、加拿大等市场未使用该药，我国也未见进口或开发报道。

头孢菌素类抗生素的过量使用具有毒副作用，主要体现在对脑神经、听觉以及肾脏的损害［5］，对人体健康造成危害。因此，世界各国对动物源性食品中的头孢洛宁残留量均提出了限量要求，欧盟规定牛奶中头孢洛宁的最高残留限量(MRL)为10 μg/kg［6］，日本肯定列表规定牛组织和牛奶中头孢洛宁的最高残留限量均为 10 μg/kg［7］。

国外头孢洛宁乳房注入剂(Cepravin Dry Cow 250 mg Intramammary suspension(Dry Cow))已上市使用多年，但有关牛奶中头孢洛宁残留检测方法的报道较少，主要有微生物法［8］、酶联免疫分析法［9，10］和高效液相色谱-串联质谱法［11，12］。牛奶中头孢洛宁的MRL为10 μg/kg，且牛奶中干扰基质较多，HPLC法不能满足残留检测的要求。本研究采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)分析牛奶中头孢洛宁残留，并进行了方法学评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000电喷雾-串联四极杆质谱仪，配Analyst 4.1.5软件(美国应用生物系统公司);Agilent 1200型液相色谱仪(美国安捷伦公司);B-260型恒温水浴锅(上海雅荣生化仪器设备有限公司);Milli-Q纯水机(美国Millipore公司);Mach1.6 R冷冻型离心机(美国Thermo公司)。头孢洛宁标准物质:产品编号32904，CAS号5575-21-3，由美国 Sigma公司提供;正己烷为国产分析纯;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(美国Fisher公司)。

1.2 溶液的配制

头孢洛宁标准储备液(500 mg/L):准确称取头孢洛宁标准物质5.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用30%(v/v)乙腈水溶液溶解并定容至刻度，配成500 mg/L标准溶液，于4℃冰箱中避光保存。临用前用甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)稀释成头孢洛宁系列标准工作液，现用现配。0.1%甲酸水溶液:取1 mL甲酸，置于1 000 mL容量瓶内，用超纯水定容至刻度，超声后使用。甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v):取30 mL甲醇与70 mL 0.1%甲酸水混匀即得。

1.3 样品前处理

准确称取(1.00±0.01)g牛奶置于15 mL离心管中。加入5 mL乙腈，涡旋1 min，置于振荡器上以 300 r/min振荡10 min，在 4℃条件下，以9 000 r/min离心10 min。转移上清液至10 mL试管中，在37℃水浴中氮气吹干，加入1 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)复溶，涡旋1 min，溶液转移至2 mL离心管中，加入0.8 mL正己烷除脂，涡旋1 min，在4℃下15 000 r/min离心10 min，弃去正己烷，过0.22 μm有机相针式过滤器至2 mL棕色进样瓶中，LC-MS/MS分析。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱:美国Penomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm);流动相:乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱程序:0.0～0.5 min，10%B;0.5～1 min，10%B～95%B;1～4 min，95%B;4～4.5 min，95%B～10%B;4.5～10 min，10%B。流速:0.25 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5 μL。

1.4.2 质谱条件

用多反应监测(MRM)扫描模式;电喷雾离子源(ESI);正离子扫描;电喷雾电压4 kV;离子源温度600℃;辅助气压力35 kPa;雾化气压力55 kPa;气帘气压力15 kPa。头孢洛宁的MRM质谱检测参数:选择离子对 m/z 459.4/337.3，459.4/152.3，其中定量离子对为m/z 459.4/337.3;碰撞能量(CE)14 eV;去簇电压(DP)70 V;碰撞室射出电压(CXP)10 V，射入电压(EP)10 V。

2 结果与讨论

2.1 质谱参数的确定

头孢洛宁标准溶液(1 mg/L)分别在正离子和负离子模式下全扫描，发现头孢洛宁在正离子模式下的响应值更高。头孢洛宁标准溶液(1 mg/L)在正离子模式下全扫描，得到［M+H］+(m/z 459.4)准分子离子峰。对m/z 459.4进行二级质谱全扫描，得到头孢洛宁二级全扫描质谱图(见图1)。结合头孢菌素质子化离子的一般断裂规律［13］可知，头孢洛宁的质谱行为较简单，主要为R2断裂(见图2)得到的 m/z 123.4和337.3;C(6)-C(7)键及C(7)-C(8)键断裂导致β-内酰胺环开环得到的m/z 152.3和309.3;而m/z 337.3进一步裂解又可得到m/z 152.3。其中m/z 337.3和152.3的强度相对较大，干扰较小，故选择m/z 337.3作为定量离子，m/z 152.3为辅助定性离子。

图1 头孢洛宁的二级质谱图Fig.1 MS/MS spectrum of cefalonium

图2 头孢洛宁的结构式Fig.2 Chemical structure of cefalonium

2.2 色谱条件的优化

头孢洛宁属于β-内酰胺酶类抗生素，结构式中既有游离羧基，又带有氨基，为两性物质，极性小［14］。所选色谱柱的填料应为直链烷烃键合的硅胶，其中最常见的为十八烷基键合硅胶(即C18)。研究对比了Phenomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)和 Waters C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)色谱柱。两种色谱柱对头孢洛宁均有良好的保留，头孢洛宁均可得到优异的峰形。综合考虑，本文选择Phenomenex Luna C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)色谱柱。为了改善峰形及提高分离度，增强目标物在反相色谱柱上的保留，经常在流动相溶液中添加甲酸、乙酸等酸性物质或者甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。在水相中添加0.1%的甲酸［15］及对流动相条件的调整能使头孢洛宁在色谱柱上较好的保留(保留时间在6.1 min左右)，响应值高，峰形优良。

2.3 样品前处理方法的优化

2.3.1 样品前处理方法的考察

有关牛奶中头孢洛宁残留检测方法报道的文献资料中，有的采用离心的方法预先除去脂肪［11］，有的采用乙腈沉淀蛋白［16］，有的添加pH 8.5磷酸盐缓冲液稀释牛奶［12］然后过固相萃取(SPE)柱净化。文献报道的样品前处理方法中，大部分都包含了操作繁琐的SPE净化步骤，成本较高。国家标准方法［16］称取5 g牛奶，最后定容至2 mL，浓缩了约2.5倍，SPE柱净化后样品足够干净。本方法称取1 g牛奶，最后定容至1 mL，正己烷除脂后，采用空白基质匹配标准溶液法［17］进行校准，检测结果显示样品同样足够干净。而本试验无需SPE柱净化，成本较低，简便易行，效率高，定量限为2 μg/kg，灵敏度更高。

2.3.2 提取液及浓缩条件的选择

牛奶中蛋白质较多，本试验比较了乙腈、甲醇和乙醇沉淀蛋白的效果，结果发现乙腈的沉淀效果更好，头孢洛宁的回收率较高，在75%以上;甲醇和乙醇沉淀蛋白效果不如乙腈，且回收率也相对低些(约60%)，所以最后选用乙腈作为蛋白沉淀剂。考察了沉淀1 g牛奶中蛋白质所需要的乙腈的体积，尝试过4、5、6、8、10 mL。4 mL 时提取不充分，回收率约65%;5 mL时回收率为75%～85%;连续增加乙腈体积至10 mL，回收率几乎没有提高。为了节约试剂及提高方法的简便性，最终确定采用5 mL乙腈进行提取。氮气流吹干浓缩时考察了温度分别为30、37、40℃时对头孢洛宁的影响。结果表明30℃下浓缩效率低，单个样品吹干所需时间为1.2 h，回收率为74%～80%;40℃下浓缩效率高，但头孢洛宁有所降解，回收率只有58%～65%;在37℃时浓缩效率较高，单个样品吹干所需时间为40 min，且头孢洛宁降解不明显，回收率为75%～87%。在浓缩吹干后，加入1 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)复溶，加入正己烷进一步除去脂溶性杂质，低温高速离心后过0.22 μm滤膜可保证样品足够干净。

2.4 标准曲线和线性范围

准确称取1 g空白牛奶7份分别置于15 mL离心管中，按1.3节方法处理样品，用所得空白基质液分别配制头孢洛宁标准工作液(2、5、10、20、50、100、200 μg/L)，用HPLC-MS/MS进行检测。每一水平设5个平行样品同日检测，连续测定5日。以头孢洛宁峰面积平均值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X，μg/L)绘制标准曲线，求得牛奶中头孢洛宁的回归方程Y=2 944.9X+2 227.5，相关系数r=0.999 6。

2.5 检出限和定量限

准确称取空白牛奶1 g，依次加入不同质量浓度(1、5、10、20、50 μg/L)的头孢洛宁标准工作液 100 μL，涡旋混匀，使得样品中头孢洛宁的添加浓度分别为 0.1、0.5、1、2、5 μg/kg，按 1.3 节方法处理样品。以S/N≥3确定检出限(LOD)，以S/N≥10确定定量限(LOQ)。牛奶中头孢洛宁的检出限为0.5 μg/kg，定量限为 2 μg/kg。

2.6 回收率和精密度的测定

回收率和精密度采用在空白牛奶中添加标准溶液的方法进行检测。其MRM谱图见图3和图4。根据残留限量要求及欧盟对头孢洛宁设置的MRL，在 LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL 4 个添加水平，1 g空白牛奶中分别添加20、50、100、200 μg/L 的头孢洛宁标准工作液100 μL，即牛奶中添加浓度为2、5、10、20 μg/kg，旋涡混匀，按1.3节方法处理样品，每一水平设5个平行样品同日检测，连续测定5日。求得空白牛奶中添加头孢洛宁回收率的平均值(X)和标准差(SD)，同时计算日内和日间相对标准偏差。结果表明，头孢洛宁在牛奶中的平均回收率介于78.5%～86.2%之间，日内相对标准偏差为1.5%～6.2%，日间相对准偏差为2.9%～5.6%(见表1)。

图3 空白牛奶的MR M谱图Fig.3 MR M chromatogram of a blank milk sample

图4 空白牛奶添加2 μg/kg头孢洛宁的MR M谱图Fig.4 MR M chromatogram of a blank milk sample spiked with cefalonium at 2 μg/kg

2.7 稳定性

取20份空白牛奶，添加MRL水平的头孢洛宁标准溶液，按1.3节方法处理样品，用HPLC-MS/MS进行检测，记录其峰面积;于室温条件下放置24 h后重新检测，比较两次峰面积的变化。结果显示，牛奶样品中头孢洛宁的峰面积变化在－3.35%～3.80%之间，说明样品在室温条件下放置24 h内，头孢洛宁稳定性良好。

表1 牛奶中头孢洛宁的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 1 R ecoveries and relative standard deviations(R SDs)of cefalonium spiked in milk(n=5)

2.8 基质效应的消除

样品基质溶液对待测物的电喷雾离子化影响较大，可抑制或增强信号响应，导致检测结果的准确度与精密度降低。本试验通过在空白牛奶基质提取液中添加低、中、高3 个浓度即2、20、200 μg/L 的头孢洛宁标准溶液，与纯溶剂中的信号强度进行比较，牛奶基质峰面积与纯溶剂的峰面积比值分别为64%～92%、75%～88%、80%～86%，说明牛奶基质对头孢洛宁检测有抑制效应。为消除样品基质效应的影响，采用空白基质匹配标准溶液法进行校准。

2.9 抽样检测

从不同市场购买新鲜牛奶10份，从超市购买国产蒙牛、伊利品牌盒装牛奶各10份，以及新西兰、澳大利亚进口盒装牛奶各10份，每份100 mL，共50份样品，按本方法进行样品前处理和检测。结果显示，所有国产样品均未检测出头孢洛宁残留，有1份新西兰进口样品检测出8.0 μg/kg头孢洛宁残留。这是因为头孢洛宁在国内尚未批准使用，有关头孢洛宁防治奶牛乳房炎的制剂还处于研发阶段，尚未投入生产。上述结果表明该方法可用于检测牛奶中头孢洛宁的残留量。

3 结论

本文建立了HPLC-MS/MS测定牛奶中头孢洛宁残留量的分析方法。样品经乙腈提取，氮气吹干后用甲醇-0.1%甲酸水溶液(3∶7，v/v)复溶，正己烷去除脂肪后，经HPLC-MS/MS分析。本方法前处理操作简便易行，不需要SPE柱净化，所需试剂较少，成本较低，且精密度和重复性好，灵敏度高，定量限低于欧盟对牛奶中头孢洛宁制定的最高残留限量，适用于牛奶中头孢洛宁的残留检测。

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