ERCC1和Survivin预测96例NSCLC化疗疗效*

于 英，何 朗，郭翠华，潘荣强

(川北医学院第二临床医学院·四川省南充市中心医院，四川 南充 637000)

以铂类为基础的化疗方案在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗中虽占据着重要地位，但疗效已达平台期。报道已初步证实一些肿瘤分子指标的变化与化疗疗效及铂类耐药密切相关。剪切修复偶联因子1(ERCC1)是核苷酸外切修复家族中的重要成员，也是核苷酸切除修复(NER)途径的关键基因，它是人类第一个被克隆的NER因子，在核酸损伤修复过程中起着重要作用。存活蛋白(Survivin)属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一。目前多认为Survivin是一个双功能蛋白，除抑制凋亡外，还参与有丝分裂调节和新生血管形成。我们通过检测 ERCC1和 Survivin在NSCLC中的表达，以初步探索两者对化疗疗效的预测价值，从而为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2007年12月～2010年12月在川北医学院第二临床医学院住院的96例初治晚期NSCLC患者，均有明确病理学诊断，男性68例，女性28例;年龄37岁～82岁，中位年龄60岁，＜60岁39例，≥60岁57例;吸烟者63例，非吸烟者33例;依据2003年WHO肺癌的组织学分类标准分为鳞癌41例，腺癌44例，腺鳞癌11例，高和中分化癌45例，低分化癌51例;按1997年肺癌的UICC分期标准分为ⅢB期33例，Ⅳ期63例;周围型肺癌有67例，中央型29例。电话随访其生存状况，随访率为100%。入组前未接受化放疗，PS≤2，预计生存期＞3月，无化疗禁忌，签署知情同意书，依从性好。有精神病史、其他恶性肿瘤史及严重或未控的内科疾患或感染者排除。所有患者行含铂化疗方案化疗至少2周期，2周期后评价疗效。

1.2 化疗方法

化疗方案分别为紫杉醇+顺铂(紫杉醇135mg/m2，d1;顺铂 75mg/m2，d1)、长春瑞滨 + 顺铂(长春瑞滨25mg/m2，d1、8;顺铂 75mg/m2，d1)和吉西他滨+顺铂(吉西他滨1000 mg/m2，d1、8;顺铂75mg/m2，d1)，化疗2周期后评价疗效并随访其1年生存状况。

1.3 实验方法

1.3.1 主要抗体及试剂 鼠抗人ERCC1单克隆抗体(ZMED公司，产品编号ZM-0138);第二代即用型免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒(福建迈新生物技术公司):包括试剂A(增强剂)和试剂B(酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物)。兔抗人Survivin多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术公司，产品编号ZA-0458);PV-6000通用二步法免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3.2 免疫组化染色 本实验采用IHC进行ERCC1及Survivin的检测，预实验得出ERCC1最佳IHC方法为两步法(Elivision，过夜)，抗原修复方式为枸橼酸高压锅修复，工作浓度1∶50;Survivin为两步法(Envision，过夜)，抗原修复方式为EDTA高压锅修复，工作浓度1∶100。ERCC1的阳性对照采用强阳性表达组织扁桃体，着色为细胞核;Survivin的阳性对照组织为乳腺癌组织，为胞浆和/或胞核内颗粒积聚。

1.4 结果评价标准

1.4.1 IHC结果判定标准 ERCC1主要呈细胞核染色，染色结果的判定参照Wachters［1］提出的评判标准，即在高倍视野(×400)下随机计数300个肿瘤细胞，如果该高倍视野内肿瘤细胞小于300，则至少应该大于150，当计数肿瘤细胞核不染色或染色阳性细胞数＜10.0%时则判定为阴性表达(-);视野中核染色阳性细胞数﹥10.0%时则判定为阳性表达(+)。Survivin着色于胞浆和/或胞核内，依据Tanaka［2］的评判标准:H=N×I。H ﹥1为阳性，H≤1则为阴性。阳性细胞数记分(N)为5个高倍视野阳性细胞数的百分率。共分5个等级:0分，＜5.0%;1 分，5.0% ～ 25.0%;2 分，25.0% ～50.0%;3 分，50.0% ～75.0%;4 分，＞75.0%。着色强度记分(I)为:1分，弱阳性(+);2分，中度阳性(++);3分，强阳性(+++)。

1.4.2 化疗疗效评价标准 参照WHO实体瘤疗效评定标准:完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(NC)和进展(PD)。以(CR+PR)数/病例总数为化疗有效率(RR)。

1.5 统计分析

采用SPSS17.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验;生存分析用Kaplan-Meier法，采用Log-rank法检验;利用COX比例风险回归模型探讨研究因素与预后之间的关系，并估计出相对危险度。

2 结果

2.1 ERCC1、Survivin在 NSCLC 中的表达

ERCC1主要在细胞核中表达，表现为棕黄色颗粒;Survivin主要呈胞浆和/或胞核着色。96例NSCLC中ERCC1阳性率为58.3%(56/96)，阴性率为41.7%(40/96);Survivin 阳性率为 76.0%(73/96)，阴性率为24.0%(23/96)。见图1，2。

2.2 ERCC1、Survivin 预测近期疗效

96例NSCLC患者中，ERCC1阳性组患者CR 0例，PR 13例，其化疗有效率为23.2%(13/56);ERCC1阴性组患者CR 1例，PR 21例，化疗有效率为55.0%(22/40)，ERCC1阴性组化疗有效率高于阳性组(Ρ＜0.05)。Survivin阳性组患者CR 1例，PR 24例，其化疗有效率为34.2%(25/73);阴性组患者CR 0例，PR 10例，化疗有效率为43.5%(10/23)，Survivin阴性组化疗有效率高于阳性组，但差异没有统计学意义(Ρ＞0.05)。(表1)

图1 ERCC1在中分化肺鳞癌胞核中的阳性表达(Elivision，×400)Figure1 The positive expression of ERCC1 in nucleus of moderately differentiated squamous cell carcinoma of lung(Elivision，×400)

图2 Survivin在中分化肺腺鳞癌胞浆中阳性表达(Envision，×400)Figure 2 The positive expression of Survivin in cytoplasm of moderately differentiated adenosquamous carcinoma of lung(Envision，×400)

表1 ERCC1、Survivin阳性组和阴性组化疗疗效的比较Table 1 The comparison of efficacy of Chemotherapy between positive and negative group of ERCC1/Survivin in NSCLC

2.3 ERCC1、Survivin 与生存的关系

随访1年后64例患者死亡。ERCC1阳性组和阴性组1年生存率差异有统计学意义(χ2=6.715，P=0.010)。见图3。Survivin阳性组和阴性组1年生存率比较，差异无统计学意义(χ2=1.455，Ρ =0.228)。见图4。

图3 ERCC1不同表达组的生存曲线Figure 3 The survival curve of positive and negative group of ERCC1 in NSCLC

图4 Survivin不同表达组的生存曲线Figure 4 The survival curve of positive and negative group of Survivin in NSCLC

2.4 ERCC1、Survivin与患者临床特征间关系

96例NSCLC肿瘤组织中，ERCC1表达状态与患者性别、年龄、吸烟、病理类型、分化程度、肿瘤部位等因素并无明确关系(Ρ＞0.05)，但Ⅳ期患者ERCC1表达率要高于ⅢB期患者(Ρ=0.010)(表2)。Survivin表达与性别、年龄、吸烟、病理类型、临床分期、肿瘤部位等因素亦无明显相关性(Ρ＞0.05)，但高-中分化组别Survivin阳性率显著高于低分化组(Ρ =0.030)(表3)。

表2 ERCC1的表达与NSCLC临床特点的关系Table 2 The relationship between ERCC1 and the clinical characteristic of NSCLC

表3 Survivin的表达与NSCLC临床特点的关系Table 3 The relationship between Survivin and the clinical characteristic of NSCLC

2.5 COX回归模型分析多因素与患者预后的意义

我们将病理类型、分化程度、临床分期、肿瘤部位、性别、年龄、吸烟史、ERCC1表达、Survivin表达状态等进行多因素COX模型回归分析。最后被纳入模型且有统计学意义的影响因素为ERCC1表达状态，ERCC1阳性患者的死亡风险是阴性患者的3.390倍，而其余影响因素包括Survivin表达状态均显示与预后无关。

表4 Cox回归风险模型Table 4 Cox regression model

3 讨论

ERCC1主要在细胞核中表达，阳性产物为棕黄色颗粒，它在核酸损伤修复和凋亡过程中起重要作用，是人类第一个被克隆的核苷酸剪切修复(NER)因子，它与肿瘤的发生和起源关系密切。本试验发现96例NSCLC肿瘤组织中ERCC1阳性率较高，为58.3%(56/96)，与国外相关文献报道［3-4］类似，支持ERCC1可能与NSCLC的发病相关。Survivin主要呈胞浆和/或胞核着色，是迄今发现最强的凋亡抑制因子之一，属凋亡抑制蛋白(IAP)家族。研究表明，Survivin在大多数肿瘤组织中表达而在成人正常组织一般不表达或低表达［5-6］。本实验发现Survivin 阳性率为76.0%(73/96)，阴性率为24.0%(23/96)，在 NSCLC 肿瘤组织中高表达，支持 Li［5］和 Akyürek［6］的报道，说明 Survivin 也可能与肿瘤的发生相关，且其染色部位集中于肿瘤的细胞核和细胞浆。

含铂方案化疗对于术后或晚期NSCLC患者而言虽然是有益的［7］，但其疗效并不理想。本研究结果显示，ERCC1阴性组化疗有效率优于阳性组(55.0%VS 23.2%，Ρ ＜0.05)，这与 Olaussen［8］的试验结果一致，说明ERCC1的表达与疗效间关系可能为负相关。分析原因，铂类药物主要通过损伤肿瘤细胞DNA发挥作用，核酸损伤修复增强是铂类耐药的主要原因之一，对铂类药物的抵抗与ERCC1的过表达有关［8］，故ERCC1缺乏的细胞不能进行铂类-DNA加合物的修复，对化疗相对敏感。因此，ERCC1的表达可考虑用于预测铂类化疗方案的疗效，高水平表达者化疗疗效差，反之低水平者疗效较好。Survivin与肿瘤的耐药有密切关系，肿瘤耐药常伴随着Survivin在肿瘤组织和细胞系中的高表达，抑制Survivin的表达有可能降低细胞的耐药性，从而产生较好的化疗疗效［9］。也就是说，相对 Survivin高表达状态，低表达者可能有着更高的化疗有效率。我们的研究虽不能明确支持这一观点，但Survivin阴性组有效率却有着远高于阳性组的趋势(43.5%VS 34.2%，Ρ ＞0.05)，相信扩大样本量试验可能会得到更准确的结果。

单因素分析发现，Ⅳ期患者ERCC1表达率要高于ⅢB期患者，高-中分化癌的肿瘤患者Survivin表达明显高于低分化组(Ρ＜0.05);同样，更多的证据支持两者的表达程度与患者的生存呈负相关［10-11］，多因素分析亦支持这一观点。本试验提示ERCC1阳性患者的死亡风险明显高于阴性患者，进一步生存分析发现，ERCC 1阴性组和阳性组的1年生存率差异有统计学意义(P=0.010)。因此，ERCC1可考虑作为晚期NSCLC生存预测的指标，ERCC1阴性组的1年生存率更高。生存曲线还发现，Survivin阳性组和阴性组的1年生存率比较差异并无统计学意义(Ρ=0.228)，说明Survivin表达状态可能与患者的生存预后无关［12］，我们的研究结果与前述观点不符，分析原因可能与我们的病例中IV期病例过多，样本量较小，样本来源和试验方法的不同等相关，进一步的前瞻性大样本试验可能会解释这种差异。

我们的研究提示在近期疗效上，ERCC1阴性组化疗有效率和1年生存率均高于阳性组(Ρ＜0.05)，ERCC1与其化疗疗效及预后有关;Survivin阴性组化疗有效率和1年生存率高于阳性组，但无统计学意义(Ρ＞0.05)。但在远期疗效评价上，ERCC1和Survivin究竟充当何种角色尚不得而知，故尚需纳入多中心，大样本标本进行长期生存随访以给临床医疗提供真正有效的帮助。

［1］Wachters FM，Wong LS，Timens W，et al.ERCC1，hRad51，and BRCA1 protein expression in relation to tumour response and survival of stage III/IV NSCLC patients treated with chemotherapy［J］.Lung Cancer，2005，50(2):211-219.

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［12］Deng H，Wu RL，Zhou HY，et al.Significance of Survivin and PTEN expression in full lymph nodeexamined gasTric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(7):1013-1017.