P16INK4a及Ki-67免疫细胞化学检测对ASC-US中高级别病变检出的意义*

叶洪楠，游 珂，郭艳利，张小为，耿 力，李子健

(北京大学第三医院妇产科，北京 100191)

宫颈癌是第二常见的女性恶性肿瘤，全球每年新发病例约50万例，其中80%发生在发展中国家;我国每年新发病例约14万，约占世界宫颈癌新发病例的28.8%［1-2］。从宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)到宫颈浸润癌是一个连续的发展过程。大量临床研究证实，由高危型HPV感染进展为宫颈原位癌(Cervical cancer insitu，CIS)大约需要7～12年的时间［3］。因此早期筛查、早期诊断和早期治疗在宫颈癌的防治工作中显得尤为重要。P16INK4a基因是一种直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的抑癌基因。Ki67是一种核增殖标志基因，属于非组蛋白抗原，其表达水平的高低对评价细胞增殖活性、研究肿瘤的生物学行为和预后具有重要意义［4］。目前国内外研究普遍认为P16INK4a与Ki-67两种标记物在组织学中可以用于宫颈癌的辅助诊断、治疗效果的评价及预后判断［5-8］，但在宫颈细胞学中P16INK4a、Ki-67免疫细胞化学检测对提高宫颈高级别病变的检出作用还有待于研究。我们应用宫颈液基细胞学剩余标本进行P16INK4a及Ki-67免疫细胞化学检测，并与高危型HPV的检测结果进行比较，探讨其作为检出宫颈癌前病变的辅助方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2010年1月至2012年6月间，选取北京大学第三医院妇产科门诊因宫颈细胞学异常就诊并进行阴道镜检查及宫颈活检者50例。按照病理学诊断分为慢性炎症、CIN1、CIN2、CIN3。根据2001年美国阴道镜检查与子宫颈病理学会(ASCCP)共同制定出的宫颈癌前病变处理指南，CIN1级可以随诊观察为主，CIN2级及CIN3级危险度较高，需进行相应治疗。故本研究中，我们将CIN2级以下26例患者归为低级别病变组，CIN2级及以上24例患者归为高级别病变组。

1.2 标本处理

采用宫颈液基细胞学剩余标本，使用 Auto PREP薄层细胞制片系统制成薄层细胞学涂片，95%酒精室温固定72小时，10%中性甲醛固定30分钟，室温下蒸馏水冲洗5分钟。放入5%EDTA(pH8.0)中用微波炉强力高火档10分钟行抗原修复。室温自然冷却后，0.3%过氧化氢室温下孵育15分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。PBS洗片3次。

1.3 免疫细胞化学检测及结果判断

免疫细胞化学染色具体实验步骤如下:1、取出冷藏的TCT涂片，室温放置1小时;2、用PBS(PH=7.4)冲洗涂片3次，每次2分钟;3、每张涂片滴加100μl的3%过氧化氢溶液，室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化酶活性;4、0.01M PBS冲洗3次，每次2 分钟;5、0.01mol/L 枸橼酸缓冲液(PH 6.0)在97°C水浴锅孵育半小时，以恢复抗原性;6、待涂片恢复常温，每张涂片滴加100μl的第一抗体，4℃冷室过夜;7、0.01M PBS冲洗3次，每次2分钟。甩去PBS，每张涂片加两滴或100μl的聚合物增强剂(试剂 A)，室温下孵育20分钟;8、PBS冲洗3次，每次2分钟。甩去PBS，每张涂片滴加100μl的酶标抗兔聚合物(试剂 B)，室温下孵育30分钟;9、PBS冲洗3次，每次2分钟。甩去PBS，每张涂片滴加100μl新鲜配制的DAB显色液，显色3～5分钟，苏木素复染45秒钟，0.5%盐酸酒精分化，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

结果判定:采用半定量的方法统计阳性细胞数目，具体操作方法为选取代表性的几个高倍视野计数300个细胞，计算着色鳞状上皮细胞所占比例，并乘以100作为Ki-67的标记指数［9-10］，p16采用相同的方法。

1.4 诊断标准

液基细胞学采用2001年TBS(The Bethesda System，伯塞斯达系统)诊断标准。

1.5 高危型HPV-DNA检测

采用免疫捕获杂交二代(Hybird Capture II，HCII)法。

1.6 统计方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。由于P16INK4a及Ki-67的原始数据为非正态分布，故进行数据转换，获得新变量lgP16INK4a及lgKi-67后，数据呈正态分布，进行后续统计分析。采独立样本t检验及单因素方差分析比较不同组别P16INK4a及Ki-67的表达，当 P＜0.05认为差异具有统计学意义。对P16INK4a及Ki-67的表达绘制ROC曲线，并根据灵敏度和特异度之和最大的原则选取相应界值及计算相关统计学指标。

2 结果

2.1 细胞学与宫颈组织病理学诊断

50例患者中，细胞学诊断为ASC-US(atypical squamous cells of undetermined significance，诊断意义不明的不典型鳞状细胞)、LSIL(low-grade squamous intraepithelial lesion，低度鳞状上皮内病变)和HSIL(high-grade squamous intraepithelial lesion，高度鳞状上皮内病变)的分别为27例、10例和13例，其与组织病理学诊断结果的对应关系见表1。

表1 细胞学诊断与组织病理学关系

2.2 高危型HPV预测ASC-US患者中高级别宫颈病变准确度

27例ASC-US中高危型HPV阳性23例，组织病理学诊断CIN2及以上病变共11例(见表2)，由表1计算得出高危型HPV预测高级别病变的敏感度为1(11/11)、特异度为0.25(4/16)、阳性预测值为0.478(11/23)、阴性预测值为1(4/4)。

表2 ASC-US中高危型HPV检测与宫颈组织病理学的关系

2.3 P16INK4a检测预测宫颈异常细胞学及ASC-US患者中高级别宫颈病变准确度

2.3.1 P16INK4a表达与宫颈组织病理学诊断的关系 在CIN2及以上组和CIN2以下组中，P16INK4a的表达量差异具有统计学意义(t=4.811，P＜0.05)，在炎症组 CIN1组、CIN2 组、CIN3 组中，其表达量随CIN级别升高而升高，且组间差异有统计学意义(F=16.094，P ＜0.01)(见图1，表3)。

图1 P16INK4a表达与宫颈组织病理学诊断的关系

表3 P16INK4a的表达

2.3.2 P16INK4a在宫颈异常细胞学及 ASC-US 中对高级别病变预测的准确性 对于全部50例样本中P16INK4a的表达绘制ROC曲线，以敏感度及特异度的和最大为标准确定界值，选取12.25为界值(见图2)。在全部50例异常细胞学样本中P16INK4a预测高级别病变的敏感度为0.792(19/24)、特异度为0.808(21/26)、阳性预测值为 0.792(19/24)、阴性预测值为0.808(21/26)(见表4);在27例 ASCUS样本中P16INK4a预测高级别病变的敏感度为1(11/11)、特异度为 0.875(14/16)、阳性预测值为0.846(11/13)、阴性预测值为1(14/14)(见表5)。

图2 P16INK4a表达在异常细胞学中检出高级别病变的ROC曲线

表4 异常细胞学中P16INK4a表达量与宫颈组织病理学关系

表5 ASC-US中P16INK4a表达量与宫颈组织病理学关系

2.4 Ki-67检测预测宫颈异常细胞学及ASC-US患者中高级别宫颈病变的准确性

2.4.1 Ki-67表达与宫颈组织病理学诊断的关系

在CIN2及以上组和CIN2以下组中，Ki-67的表达量差异具有统计学意义(t=4.698，P ＜0.05)，其中炎症组、CIN1组、CIN2组、CIN3组中，其表达量随CIN级别升高而升高，且组间差异有统计学意义(F=15.177，P ＜0.01)(见图 3，表6)。

图3 Ki-67表达与宫颈组织病理学诊断的关系

表6 宫颈不同病变Ki-67的表达

2.4.2 Ki-67在宫颈异常细胞学及ASC-US中对高级别病变预测的准确性 对于全部50例样本中Ki-67的表达绘制ROC曲线，以敏感度及特异度的和最大为标准确定界值，选取12.5为界值(见图4)在全部50例异常细胞学样本中，Ki-67预测高级别病变的敏感度为0.708(17/24)、特异度为0.846(22/26)、阳性预测值为 0.810(17/21)、阴性预测值为0.759(22/29)(见表7);在27例 ASC-US样本中Ki-67预测高级别病变的敏感度为0.818(9/11)、特异度为 0.875(14/16)、阳性预测值为 0.818(9/11)、阴性预测值为0.875(14/16)(见表8)。

图4 Ki-67表达在异常细胞学中检出高级别病变的ROC曲线

表7 异常细胞学中Ki-67表达量与宫颈组织病理学关系

表8 ASC-US中Ki-67表达与宫颈组织病理学学诊断的关系

2.5 P16INK4a及Ki-67与高危型HPV在ASC-US中分流管理作用的比较

2.5.1 P16INK4a与高危型 HPV 在 ASC-US 中分流管理作用的比较 通过表9可以看出，P16INK4a检测在ASC-US中预测宫颈高级别病变的特异度和阳性预测值均显著高于高危型HPV检测;敏感度和阴性预测值二者相当。

表9 P16INK4a和高危HPV检测在ASC-US中的分层价值比较

2.5.2 Ki-67与高危型HPV在ASC-US中的分流管理作用的比较 通过表10可以看到，Ki-67检测在ASC-US中预测宫颈高级别病变的特异度和阳性预测值均显著高于高危型HPV检测;敏感度和阴性预测值略低于高危型HPV。

表10 Ki-67和高危HPV检测在ASC-US中的分层价值比较

3 讨论

目前对宫颈癌前病变的早期筛查主要采用细胞学检测，液基细胞学检测(liquid based cytology test，LCT)弥补了传统细胞涂片法的一些不足，能较为有效地筛检宫颈癌前病变及早期宫颈癌，但是该方法存在一定的假阴性和假阳性，会造成一部分高危患者的漏诊，因此需要通过联合一些辅助诊断，提高细胞学筛查的准确性。将P16INK4a及Ki-67作为诊断宫颈病变的标记物已经得到普遍认可［11-12］。之前的研究多采用免疫组化的方法对P16INK4a及Ki-67进行检测，免疫组化检测需活检组织，对患者有一定的创伤，且存在一定比例的假阴性和假阳性。与组织学标本相比，采用宫颈脱落细胞检测P16INK4a、Ki-67，不仅具有取材方便、无创的特点，同时又可以极大的减小细胞学单纯依赖细胞形态学改变为诊断依据对结果带来的主观影响。因此，这一新方法对降低传统宫颈癌筛查法的假阳性率和假阴性率，提高筛查的敏感度和特异度都具有重要意义。

本研究显示，P16INK4a的表达水平随着宫颈病变级别的升高而提高。近年研究表明，在几乎所有HPV阳性的宫颈癌及癌前病变中P16INK4a呈高表达，且细胞学诊断为HSIL的表达率显著高于LSIL的表达率［13］。Horn等［14］研究表明，P16INK4a蛋白表达可作为判断宫颈癌恶性程度的指标。Juric等［15］研究显示，P16INK4a过表达对诊断宫颈高危病变及宫颈癌具有重要价值，这些研究均支持我们的研究结果。本研究中，Ki-67的表达水平随着宫颈病变级别的升高而提高。其他研究表明，随着宫颈上皮细胞病变程度增加，其表达率明显升高［16］。正常情况下，Ki-67表达于成熟宫颈鳞状上皮的基底细胞和基底旁细胞，随着宫颈癌前病变的加重，Ki-67的表达向上皮表层上移，其在鳞状上皮上2/3层生的表达被认为提高了CIN诊断的特异度［17］。这些均与我们的结果一致。易为等［18］研究还发现，Ki-67单独用于诊断宫颈病变漏诊率小，但误诊率高。

由于宫颈脱落细胞中P16INK4a及Ki-67的表达水平随宫颈病变级别升高而升高，因此我们需要找到一个临界点，使P16INK4a及Ki-67诊断宫颈高级别病变的灵敏性和特异度有最佳的结合。“接受者操作特性曲线(ROC曲线)”是一种反应某个诊断指标的效度的方法，也是确定最佳诊断参考值的有效方法。ROC曲线下面积(AUC)可用于评价诊断准确性，其值在0.5至1之间。AUC越接近于1，说明诊断效果越好。本研究所有病例的P16INK4a的界值为12.25，ROC曲线下面积达到0.848(95%可信区间0.734 ～0.961，p＜0.05);Ki-67 的界值为 12.5，ROC曲线下面积达到0.856(95%可信区间0.753～0.959，p＜0.05)。以上结果说明通过免疫细胞化学方法检测宫颈脱落细胞P16INK4a及Ki-67的表达水平对检出宫颈高级别病变具有很好的效度。我们比较了P16INK4a及Ki-67对于异常细胞学以及ASCUS中高级别病变预测的准确性。我们发现，细胞学诊断为ASC-US的P16INK4a及Ki-67对高级别病变预测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均要优于异常细胞学，这说明相对于LSIL及HSIL，P16INK4a及Ki-67对于ASC-US中高级别病变预测的准确性更高。

大量研究结果表明，ASC-US可能是反应性变化，也可能隐藏着宫颈病变［19］。Srodon等［20］研究认为，宫颈细胞学检查为ASC-US的患者中有5%～10%为宫颈高级别病变，宫颈浸润癌约占0.1%。对于ASC-US病例若只进行随访，部分患者会丧失最佳治疗时机;若全部直接进行阴道镜检查及宫颈活检，又会使大量良性病变患者承受不必要的检查，造成医疗资源的浪费。有研究表明在ASC-US中，高危型HPV检测相对于细胞学检测其检出高级别病变的敏感度可以提高10% ～15%［21］，因此高危型HPV检测对于ASC-US具有分流管理的作用。本研究病例中，ASC-US中高危型HPV检测CIN2及以上病变的敏感度为1、特异度为0.25、阳性预测值为0.478、阴性预测值为1。可见高危型HPV检测在ASC-US中检出高级别病变具有令人满意的灵敏度和阴性预测值，但特异度和阳性预测值不尽如人意。另有报道称HPV检测和细胞学筛查联合后虽然提高了检出高级别病变的敏感度，但降低了特异度［22-23］。因此有必要寻找一种具有更高特异度和阳性预测值的生物学指标。在本研究中，我们比较了高危型HPV检测和P16INK4a、Ki-67检测在预测ASC-US中高级别病变的准确性的差异，发现P16INK4a及Ki-67检测的特异度和阳性预测值明显高于高危型HPV，而敏感度、阴性预测值两者相当。这说明单独应用P16INK4a或Ki-67免疫细胞化学检测对ASC-US中高级别病变进行预测不仅保留了高危型HPV检测较高的敏感度和阴性预测值，同时弥补了高危型HPV检测在特异度和阳性预测值上的不足，因此单独应用P16INK4a或Ki-67免疫细胞化学检测对ASC-US中高级别病变进行预测其准确性要优于单独应用高危型HPV检测。

综上，高危型HPV检测对细胞学诊断为ASCUS的患者的进一步处理具有分流管理的意义，但存在低特异度和低阳性预测值的缺陷。本研究表明，单独应用P16INK4a或Ki-67免疫细胞化学检测对ASC-US中高级别病变的检出作用均要优于高危型HPV检测。因此本研究提示宫颈脱落细胞P16INK4a及Ki-67免疫细胞化学检测相比于高危型HPV检测可以提高对ASC-US中高级别病变的检出作用。后续我们还需要更大样本量的临床观察和实验来验证此结论。

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