D-CIK治疗抑制进展期乳腺癌中循环肿瘤细胞的初步研究

马磊，伍思培，邓旭斌，金川，陆勤，刘晓燕，陈文晟，邹青峰

（1.广州医科大学附属肿瘤医院内三科广州医科大学肿瘤研究所，广东 广州 510095；2.广东省人民医院肺癌研究所，广东 广州 510080）

·论著·

D-CIK治疗抑制进展期乳腺癌中循环肿瘤细胞的初步研究

马磊1，伍思培2，邓旭斌1，金川1，陆勤1，刘晓燕1，陈文晟1，邹青峰1

（1.广州医科大学附属肿瘤医院内三科广州医科大学肿瘤研究所，广东 广州 510095；2.广东省人民医院肺癌研究所，广东 广州 510080）

目的探讨D-CIK治疗对进展期乳腺癌外周血中循环肿瘤细胞数的变化情况及意义。方法采用Cellsearch检测系统对32例明确诊断为进展期乳腺癌患者分别在CIK细胞回输治疗前后检测外周血中循环肿瘤细胞数目变化情况，同时观察治疗过程中患者的相关不良反应。结果患者接受D-CIK治疗后，循环肿瘤细胞的数目明显减少，由治疗前的5～18个/7.5 ml减少为治疗后的2～11个/7.5 ml，两者差异具有统计学的意义(P＜0.05)。治疗过程中未见明显不良反应。结论D-CIK治疗可明显降低患者外周血中循环肿瘤细胞的数目。

D-CIK；乳腺癌；循环肿瘤细胞

乳腺癌是危害人类健康的高发恶性肿瘤，不论是在发达国家还是在我国，均为女性最常见的恶性肿瘤类型。在我国目前乳腺癌的发病率为41.64/10万，死亡率为9.63/10万[1]；在美国2013年一共有232 340例新发乳腺癌病例，39 620例死亡病例[2]。虽然随着医疗技术的发展，尤其是早期检测手段的实施和整体治疗方案的更新，总体死亡率在近年来呈现进行性下降趋势，但是对于伴有复发和转移的肿瘤患者，生存状况并没有得到根本的改善。肿瘤一旦发生复发转移，疾病将很难治愈，并最终导致绝大多数死亡[3]。

肿瘤的转移是一个包含多个步骤的复杂病理过程，包括肿瘤细胞的脱落、穿透基底膜、进入循环系统、继发部位克隆形成并最终形成临床可见的转移瘤。其中肿瘤细胞从癌症原发部位脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环系统是整个转移过程中的一个关键环节。目前研究证实，在肿瘤转移的过程中，可以在患者的外周血中检测到循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)。在多种实体瘤中，CTCs可以反映肿瘤负荷，预测疾病发展，协助治疗决策，比传统影像学标准更为准确和灵敏，重复性更佳。因而它的诊断和治疗价值以及在转化医学研究中的作用越来越受到科学家们的重视[4]。因为CTCs经常保持在未分化的状态，甚至有些保持在干细胞的状态，因此对常规的化疗和靶向治疗并不敏感。如何发展出特异性靶向CTCs的治疗手段，减少或者消除外周循环中CTCs的含量，阻滞肿瘤转移进程，最终降低肿瘤转移的发生率，提高最终治疗效果，延长患者总体生存时间具有重要的临床意义[5]。本次研究中，笔者试图采用Cellsearch检测系统检测D-CIK治疗前后患者外周血循环中CTCs数量的变化，初步探讨D-CIK细胞免疫疗法对CTCs的抑制作用。

1 资料与方法

1.1 入组标准经过病理学或细胞学证实的乳腺癌患者；年龄≤75岁；既往曾经使用过包括手术及放化疗在内的综合治疗，均有客观临床观察指标；末次放化疗结束至少1个月，近1个月内未作过其他抗肿瘤治疗；无脑转移及严重心功能不全；肝肾功能及血象基本正常，KPS＞70分，预计生存3个月以上；所有患者均签署书面知情同意书。

1.2 临床资料共计55例2012年6月至2014年2月于我院门诊及住院的接受免疫D-CIK治疗晚期乳腺癌患者进行了CTCs检测。其中32例患者在治疗前检测中CTCs检出率为58.2%。检测到CTCs的32例患者全部纳入到本次研究，见表1。

表1 32例患者的临床资料[例（%）]

1.3 研究方法

1.3.1 D-CIK细胞体外扩增与回输整个操作均在本单位生物层流室完成。首先采集患者外周血100 ml，使用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离和收集单个核细胞。将细胞接种在1640完全培养基中，细胞终浓度大于106/ml。经过37℃，5%CO2培养箱中培养4～6 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后收集悬浮细胞作为效应T细胞培养，贴壁细胞为DC细胞。后续培养第3天加入AIM-V培养液(含GM-CSF 800 U/ml)，第4天加入IL-4 1 000 U/ml，第6天加入TNF-α(100 IU/ml)刺激成熟，第7天检测DC表型，合格后与CIK细胞共培养。至14 d收集细胞获得D-CIK细胞，检测合格后进行细胞回输治疗。

1.3.2 循环中肿瘤细胞数目的检测采用CellSearch系统专用CellSave管，分别于治疗前和治疗后第4周抽取患者外周血，经过离心后，在CellTracks自动反应仪中进行系列免疫反应，接着在磁槽中进行孵化，最后由CellTracks自动分析仪扫描和分析结果。采样后72 h内完成实验，每次检测需至少含一次质控品。

1.3.3 不良反应的处理观察D-CIK回输过程中患者发生的不良反应，并及时给予对症处理措施。

1.4 统计学方法应用SPSSl0.0软件进行统计学分析，计量资料两组数据之间的比较采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-CIK治疗前后患者CTCs变化情况每例乳腺癌患者在接受D-CIK治疗前后，分别采用Cellsearch检测系统检测CTCs的数目。在治疗前患者CTCs的数量为5～18个/7.5 ml；治疗后数量减少为2～11个/7.5 ml，每例患者的具体数值变化见表2。采用配对t检验方法对比D-CIK治疗前后CTCs的数目。结果显示，经过D-CIK治疗后，CTCs的数量与治疗前相比较明显减少，差异具有统计学的意义(t= 13.998，P=0.000)。

2.2 不良反应整个治疗过程中均没有发现严重不良反应者，3例患者出现轻度发热，1例患者出现上肢皮疹，经对症处理后迅速缓解。

表2 D-CIK治疗前后患者CTCs变化情况

3 讨论

早在19世纪中叶已经有研究者提出循环肿瘤细胞的概念，但是由于科学技术手段的局限，对CTCs的研究一直停留在原始水平。近来随着科技的发展，已经发展出多种手段来检测及鉴定CTCs，包括Cellsearch系统，已经在敏感性和稳定性方面得到了充分的验证，并得到FDA的批准[6]。关于CTCs的临床研究在多种肿瘤中已经得到进行，如在关于乳腺癌的前瞻性多中心双盲临床试验中，共纳入177例患者。分别于治疗前、治疗开始后3～5周、6～8周、9～14周、15～20周数个不同阶段进行CTCs水平检测。结果显示治疗前CTCs高水平者预后较差，与低水平者比较，无进展生存时间(Progression-free survival，PFS)为2.7个月和7.0个月。总生存期(Overall survival，OS)为10.9个月和18.5个月。在治疗过程中不同时间点的检测结果具有同样的趋势。笔者认为不论在治疗的任何时间点进行CTCs的检测，对之后的病情变化均有准确的预测作用[7]。欧洲肿瘤研究院把CTC的数量作为连续变量进行研究，平均随访时间达到28个月。结果发现随着CTCs细胞数量的增高，PFS和OS呈现连续非线性的下降趋势，这种相关性直到数量大于5个以后才逐渐减弱[8]。在结肠癌的前瞻性多中心研究中，共纳入430例患者，分别在初始治疗前，一线、二线、三线治疗后进行CTCs的检测。结果显示治疗前CTCs高水平者预后较差，与低水平者比较PFS为4.5个月和7.9个月，OS为9.4个月和18.5个月。即使在不良预后组，如果在治疗过程中循环肿瘤细胞数量减少至3个以下，也比治疗过程中细胞数量没有明显减少的为好，两者比较，PFS为6.2个月和1.6个月，OS为1.0个月和3.7个月。笔者认为CTCs数量多少是PFS和OS的独立预后因素，并且在治疗过程中对治疗效果有预测作用[9]。

CTCs对肿瘤进程的不利影响可能与其所具有的表皮间质转换(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)和肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)的表型相关。有研究证实，在CTCs检测阳性的乳腺癌临床标本中，有97%表达Twist1、Akt2、PI3Kalpha三个重要EMT标志中的至少一个，而且有95%表达ALDH1这一重要的CSC标志。而在CTCs检测阴性的标本中这些标志的表达极为低下[10]。采用Twist和Vimentin这两个指标组合得到类似的结果，即使是在早期乳腺癌患者[11]。采用紫杉醇这些常用化疗药物处理乳腺癌细胞，除杀伤肿瘤细胞这一作用外，反而有可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移，其作用机制包括对微管系统的调节[12]。由于这些特殊表型，常规的化疗和靶向治疗并不能产生针对CTCs的治疗效果，甚至还可能促进CTCs的产生和发展。所以必须寻找可以特异性抑制CTCs的手段，才能阻断肿瘤转移过程，减少转移的发生概率，最终得到生存上的获益。

免疫治疗作为肿瘤治疗的重要手段之一，具有常规手术或者放化疗所不具有的独特优势，在肿瘤的治疗实践中得到越来越广泛的应用。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer，CIK)技术是其中较为成熟的治疗手段，而其进一步发展的D-CIK技术是指与树突细胞(Dendritic cell，DC)共培养的CIK细胞。实验证明，DC和CIK共同培养后两种细胞的数量和活性都有明显增高，同时IL-12分泌水平也有同步的增高[13]。不但对普通肿瘤细胞具有杀伤作用，并且对于那些常规化疗药物耐药的肿瘤细胞，也具有肯定的杀伤作用[14]。多个临床研究已经证实，D-CIK细胞技术可以改善肿瘤患者的PFS和OS，并且不良反应轻微[15-17]。但是其具体作用机制尚不完全明确，尤其是临床证据尚不充分。所以我们根据既往研究成果推测，D-CIK技术改善肿瘤预后的原因可能是对针对循环肿瘤细胞的特异性杀伤与抑制，从而减少肿瘤细胞进一步转移扩散的机会，最终获得临床生存的收益。

本次研究中我们发现，乳腺癌患者接受D-CIK治疗后，其循环血中肿瘤细胞数目与治疗前相比较明显减少，其差异具有统计学意义。据此我们推测，D-CIK治疗可能通过抑制CTCs来减少肿瘤复发及转移机会，但其具体机制值得进一步研究。本次研究结果对于深入理解生物免疫疗法在乳腺癌治疗中的作用与地位具有积极的意义。

[1]黄哲宙,陈万青,吴春晓,等.中国女性乳腺癌的发病和死亡现况-全国32个肿瘤登记点2003-2007年资料分析报告[J].肿瘤,2012, 32(6):435-439.

[2]Desantis C1,Ma J,Bryan L,Jemal A.Breast cancer statistics[J]. CACancer J Clin,2014,64(1):52-62.

[3]Gangopadhyay S1,Nandy A,Hor P,et al.Breast cancer stem cells: a novel therapeutic target[J].Clin Breast Cancer,2013,13(1):7-15.

[4]Budd GT,Cristofanilli M,Ellis MJ,et al.Clin Cancer Res[J].Circulating tumor cells versus imaging—predicting overall survival in metastatic breast cancer.2006,12(21):6403-6409.

[5]Zhang Y,Shi ZL,Yang X,et al.Targeting of circulating hepatocellular carcinoma cells to prevent postoperative recurrence and metastasis[J].World J Gastroenterol,2014,20(1):142-147.

[6]Riethdorf S1,Fritsche H,Müller V,et al.Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer:a validation study of the CellSearch system[J].Clin Cancer Res,2007,13(3):920-928.

[7]Hayes DF,Cristofanilli M,Budd GT,et al.Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival[J].Clin Cancer Res,2006,12(14 Pt 1):4218-4224.

[8]Botteri E,Sandri MT,Bagnardi V,et al.Modeling the relationship between circulating tumour cells number and prognosis of metastatic breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2010,122(1):211-217.

[9]Cohen SJ,Punt CJ,Iannotti N,et al.Relationship of circulating tumor cells to tumor response,progression-free survival,and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer[J].J Clin Oncol,2008,26(19):3213-3221.

[10]Aktas B1,Tewes M,Fehm T,et al.Stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers are frequently overexpressed in circulating tumor cells of metastatic breast cancer patients[J].Breast Cancer Res,2009,11(4):R46.

[11]Kallergi G,Papadaki MA,Politaki E,et al.Epithelial to mesenchymal transition markers expressed in circulating tumour cells of early and metastatic breast cancer patients[J].Breast Cancer Res,2011, 13(3):R59.

[12]Balzer EM,Whipple RA,Cho EH,et al.Antimitotic chemotherapeutics promote adhesive responses in detached and circulating tumor cells[J].Breast Cancer Res Treat,2010,121(1):65-78.

[13]Märten A,Ziske C,Schöttker B,et al.Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to an activation of both populations[J].J Immunother,2001,24(6):502-510.

[14]Wang YF,Kunda PE,Lin JW,et al.Cytokine-induced killer cells co-cultured with complete tumor antigen-loaded dendritic cells, have enhanced selective cytotoxicity on carboplatin-resistant retinoblastoma cells[J].Oncol Rep,2013,29(5):1841-1850.

[15]Zhong R,Teng J,Han B,et al.Dendritic cells combining with cytokine-induced killer cells synergize chemotherapy in patients with late-stage non-small cell lung cancer[J].Cancer Immunol Immunother,2011,60(10):1497-1502.

[16]Wang K,Gao X,Pang J,et al.Dendritic cells transduced with a PSMA-encoding adenovirus and cocultured with autologous cytokine-induced lymphocytes induce a specific and strong immune response against prostate cancer cells[J].Urol Oncol,2009,27(1): 26-32.

[17]Ren J1,Di L,Song G,et al.Selections of appropriate regimen of high-dose chemotherapy combined with adoptive cellular therapy with dendritic and cytokine-induced killer cells improved progression-free and overall survival in patients with metastatic breast cancer:reargument of such contentious therapeutic preferences[J]. Clin Transl Oncol,2013,15(10):780-788.

Inhibition of D-CIK on circulating tumor cells in advanced breast cancer.

MA Lei1,WU Si-pei2,DENG Xu-bin1, JIN Chuan1,LU Qin1,LIU Xiao-yan1,CHEN Wen-sheng1,ZOU Qing-feng1.1.The Third District of Internal Medicine Department,Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University/Cancer Center of Guangzhou Medical University (CCGMU),Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;2.Institute of Lung Cancer Research,Guangdong Provincial People's Hospital,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA.

ObjectiveTo investigate the effect of D-CIK on circulating tumor cells(CTCs)in patients with advanced breast cancer.MethodsThirty-two cases of advanced breast cancer were included.The number of tumor cells in peripheral blood circulating was detected before and after D-CIK therapy by Cellsearch system.Related adverse reactions were also observed during the treatment.ResultsAfter treatment,the number of tumor cells in peripheral blood circulating decreased from 5～18/7.5 ml(before treatment)to 2～11/7.5 ml with a statistical difference (P＜0.05).No severe side effect was observed during treatment.ConclusionD-CIK treatment could inhibit the CTCs in breast cancer.

D-CIK;Breast cancer;Circulating tumor cells

R737.9

A

1003—6350（2014）13—1884—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0732

2014-04-08)

广东省科技厅科研项目（编号：2011B080701021）；广州医学院科研项目（编号：2013C61）

马磊。E-mail：ml18882@163.com