MSRE-qPCR法检测少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平

严 鹏 任丽娟 成 振 郭大玮▲ 白丽娟 贾琳娜

1.山西医科大学法医学院，太原 030001；2.山西大医院，太原 030032

MSRE-qPCR法检测少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平

严 鹏1任丽娟2成 振1郭大玮1▲白丽娟1贾琳娜1

1.山西医科大学法医学院，太原 030001；2.山西大医院，太原 030032

目的 建立精子中父源印记基因H19上游区域MSRE-qPCR检测方法，并分析男性少弱精子症患者精子父源印记基因H19上游区域甲基化水平。 方法 收集20例正常精液样本，同时筛选30例少弱精子症患者精液样本，应用甲基化敏感性限制性内切酶法并结合定量PCR对所有样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平进行分析。 结果 正常精液样本父源印记基因H19上游区域平均甲基化率为（99.8±2.72）%，高于少弱精子症患者精液样本的（82.4±15.30）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论MSRE-qPCR法可用于父源印记基因H19上游区域甲基化水平的检测，少弱精子症者精液样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平显著低于正常人。

印记基因H19；MSRE-qPCR；少弱精子症；DNA甲基化

目前，全球约15%的育龄夫妇存在不孕不育，其中与男性相关的因素约占50%，同时该比例还在逐年增加[1]。导致男性不育的主要因素为精子异常，包括少精子症、弱精子症和畸形精子症等，已有学者研究证明父源印记基因H19甲基化状态可影响男性精子的生成，且甲基化状态降低会导致男性精子的生成障碍[2]，因此可认为父源印记基因H19甲基化状态的异常可导致男性不育。近年来，有关精子基因甲基化状态的研究逐渐增多，研究方法多是从半定量水平或间接定量水平进行分析，直接从定量水平进行分析的较少。本研究将甲基化敏感性限制性内切酶法与定量PCR相结合，建立精子中父源印记基因H19上游区域甲基化水平定量分析方法，同时筛选30例少弱精子症患者精液样本，对其父源印记基因H19上游区域甲基化状态进行分析，探讨父源印记基因H19上游区域甲基化水平异常与男性不育的关系。

1 材料与方法

1.1 精液样本采集

根据《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第五版）[3]的标准，收集20例正常精液样本，同时筛选30例少弱精子症患者精液样本，精液样本均来源于2013年11～12月在山西医科大学附属第一临床医院就诊的患者。

1.2 精子DNA提取

采用经典酚-氯仿法提取精子全基因组DNA，并用紫外分光光度法检测所提取DNA的纯度及浓度。

1.3 MSRE处理

采用甲基化敏感性限制性内切酶HhaⅠ（New England Biolabs）对所提取精子DNA进行酶切消化，同时对于同一精液样本以去离子水代替HhaⅠ设立未消化对照，酶切体系：精子基因组DNA为1～20 ng，HhaⅠ为30 U，加入适量Buffer，去离子水补至20 μl，37℃消化16 h，65℃消化20 min停止酶切。

1.4 PCR引物设计及扩增条件

根据相关文献报道，选择人类H19基因上游区域一段包含4个HhaⅠ酶切位点的区域作为第一轮常规PCR扩增区域，该区域所包含的4个HhaⅠ酶切位点在精子DNA中均为高甲基化状态，在该区域两翼设计引物，上游引物5′-GGGTCATTATAGACGCAATCG-3′，下游引物5′-AGAACCTGTTGGGCGGTTAGA-3′，扩增产物长度为1700 bp左右[4]。扩增体系：ExTaq Hot Start Version（Takara）为1.25 U，dNTP混合物（Takara）的终浓度为10 mmol/L each，模板为已消化好（对照组为未消化）的精子DNA 4 μl，引物的终浓度为10 μmol/L each，加入适量缓冲液，去离子水补至50 μl。常规PCR扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，共20个循环，72℃再延伸5 min。同时以上一步常规PCR引物为模板使用Premier Premier 6.0软件设计第二轮qPCR引物，上游引物5′-CTGGGAACACTGGGA AAG-3′，下游引物5′-AGAAACTGGGCTGATTGG-3′，扩增产物长度为147 bp，扩增体系：2×SYBRRPremix Ex TaqⅡ（Takara）为10 μl，引物的终浓度为10 μmol/L each，取上一步常规PCR扩增产物稀释20倍后取1 μl作为模板，去离子水补至20 μl。qPCR扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35个循环，结束后绘制溶解曲线。

1.5 甲基化水平分析

采用标准曲线相对定量法对精液样本甲基化水平进行分析，以百分数表示甲基化水平，甲基化水平=（消化组定量结果/未消化组即对照组定量结果）× 100%。标准曲线构建采用父源印记基因H19标准质粒（来源于山西医科大学法医学院），标准质粒经梯度稀释后与精液样本同时扩增，绘制标准曲线。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以±s表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSRE-qPCR方法评估

2.1.1 HhaⅠ酶切效率评估 以H19标准质粒检测酶切效率，将50、200、400 ng的H19标准质粒以HhaⅠ消化16 h后进行MSRE-qPCR分析，同时设计未消化对照，酶切效率=[（未消化定量结果-消化定量结果）/未消化定量结果]×100%，结果HhaⅠ对50、200、400 ng的H19标准质粒的酶切效率分别为99.9%、99.9%、99.8%。

2.1.2 PCR引物扩增评估 本研究所设计qPCR引物，其线性范围宽，扩增灵敏度高，扩增效率为103.9%，相关系数可达0.999，引物特异性好，在Tm=87.3℃时出现单一产物峰；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，两对引物均扩增特异性好，条带清晰（图1）。

图1 PCR产物琼脂糖电泳结果

2.2 样品中父源印记基因H19上游区域甲基化状态的分析

20例正常精液样本父源印记基因H19上游区域均为高甲基化状态，平均甲基化率为（99.8±2.72）%；30例少弱精子症患者精液样本父源印记基因H19上游区域甲基化状态显著降低，平均甲基化率为（82.4± 15.30）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。在30例少弱精子症患者精液样本中，有5例样本甲基化率为97% ～100%，8例样本甲基化率为90%～97%，11例样本甲基化率为 70%～90%，3例样本甲基化率为 50%～70%，2例样本甲基化率为30%～50%，1例样本甲基化率为＜20%（图2）。

图2 少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平分布

3 讨论

甲基化作为表观遗传学的重要研究内容之一，是蛋白质和核酸的一种重要修饰，与生长发育、衰老、癌症及许多疾病密切相关[5-6]，近年来，研究发现，在精子发生过程中，DNA甲基化起着重要作用[7]。DNA甲基化的修饰依赖DNA甲基转移酶 （DNA methyltransferase，DNMT），有研究发现DNMT3L敲除的雄性小鼠无生育能力，母鼠的卵子也不能建立正确的印记基因，后代在胚胎期即死亡[8]，Hata等[9-10]的研究指出，DNMT3A、DNMT3L缺陷的小鼠可表现为少精子症。Li 等[11]在研究中观察到与正常人相比，少弱精子症患者的精子质量越差，精子DNA甲基化水平越低。Kobayashi等[12]研究了97例不育男性的精液，发现其中有14.4%的样本存在父系甲基化印记H19、GTL2的异常。Marques等[2]也指出精子中H19基因甲基化异常程度越严重，精子的异常率越高。精子中H19基因甲基化的异常，可导致精子发生异常，进而导致男性不育。

辅助生育技术 （assisted reproductive technology，ART）可以避开自然受精过程中多种天然屏障而解决男性不育问题。有研究证明精子DNA甲基化的异常并不影响试管婴儿的受孕率，但精子DNA甲基化的异常可影响胚胎的发育，进而可能导致后代出现各种遗传疾病[13]。Hansen等[14]的研究表明，通过人工授精怀孕的婴儿，出生一年内被诊断出有严重生理缺陷的概率是自然怀孕所产婴儿的3倍，因此在进行ART前应对精子的甲基化状态进行仔细分析，以降低ART的风险。

精子DNA甲基化状态研究的主流方法是依赖重亚硫酸盐修饰并结合其他相关技术进行甲基化状态的分析，主要包括重亚硫酸测序、甲基化特异性PCR、甲基化特异性单核苷引物延伸、重亚硫酸盐限制酶组合分析等[15-17]。重亚硫酸盐可以将胞嘧啶转变为尿嘧啶，这些方法可以很好的分析相关基因中CpG岛的甲基化状态，但是其多操作复杂，工作量大，且在定量方面存在一定局限性。本研究使用MSRE-qPCR法分析精子中父源印记基因H19上游区域甲基化水平，其方法操作简便，线性范围宽，灵敏度高，重复性好，可以快速、定量地分析精子中父源印记基因H19上游区域甲基化水平，基本可以达到科研及临床检测的要求。本研究结果显示，少弱精子症患者精子DNA中父源印记基因H19上游区域甲基化水平与正常精子有显著差异，提示精子DNA H19上游区域甲基化水平与少弱精子症有一定相关性，且少弱精子症者精子中父源印记基因H19上游区域甲基化水平显著低于正常人。

综上所述，本研究所建立的方法可以快速、定量地分析精子中父源印记基因H19上游区域甲基化水平，下一步研究除继续筛选不育男性精子中甲基化异常的代表性基因外，还应对不育男性精子DNA中甲基化水平达到多少即可进行ART而不会产生其他问题等展开深入研究。

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The methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient by MSRE-qPCR

YAN Peng1REN Li-juan2CHENG Zhen1GUO Da-wei1▲BAI Li-juan1JIA Lin-na1
1.Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China

ObjectiveTo establish the methylation level of upstream of H19 paternal imprinted gene in semen of oligasthenospermia patient and analyse the methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient.MethodsThe methylation level in the upstream of the H19 paternal imprinted gene of abnormal(30 olig-asthenospermia samples)and normal(20 normal semen samples)was detected respectively by conducting the methylation sensitive restriction endonucleases-quantitative polymerase chain reaction(MSRE-qPCR,asemiquantitative DNA methylation analytical method).ResultsThe average methylation rate in the upstream of the H19 paternal imprinted gene in normal semen samples was(99.8±2.72)%,higher than that in olig-asthenospermia samples(82.4±15.30)%, with statistical difference(P＜0.01).ConclusionThe method of MSRE-qPCR can be used in the methylation level detection of upstream of the H19 paternal imprinted gene of semen,and the methylation level of upstream of the H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient is much lower than that in normal person.

H19 paternal imprinted gene;MSRE-qPCR;Olig-asthenospermia;DNA methylation

R698

A

1674-4721（2014）03（c）-0012-04

2014-02-11本文编辑：李亚聪）

教育部高等学校博士学科点专项科研基金（2011 1417110003）

▲通讯作者