黄芪注射液对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的干预作用

李琳琳申绯翡马雷雷李亚东*

(1 北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2 洛阳职业技术学院，河南 洛阳 471000；3 北京中医药大学基础医学院，北京100029)

黄芪注射液对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的干预作用

李琳琳1申绯翡2马雷雷1李亚东3*

(1 北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2 洛阳职业技术学院，河南 洛阳 471000；3 北京中医药大学基础医学院，北京100029)

目的 观察黄芪注射液对体外培养人胚肺成纤维细胞增生以及细胞外基质合成的影响。方法 用0～400 mg/mL浓度的黄芪注射液作用于体外培养的人胚肺成纤维细胞，24～72 h后观察不同浓度的黄芪注射液对成纤维细胞增殖活性及其功能的影响。MTT法观察成纤维细胞的生长活性，天狼猩红染色观察胶原生成情况。结果 与对照组相比，在25～200 mg/mL浓度作用下，黄芪注射液对成纤维细胞的生长具有促进作用；在400 mg/mL浓度作用下，黄芪注射液能够明显抑制人胚肺成纤维细胞的增殖。结论 黄芪注射液在高浓度条件下抑制人胚肺成纤维细胞的生长，中低浓度下促进成纤维细胞的生长，呈现剂量依赖性。

黄芪注射液；人胚肺成纤维细胞；细胞外基质

肺纤维化的形成与肺组织反复损伤后的过度修复有关，表现为肺ECM合成与降解稳态失衡，尤其是胶原代谢失衡[1]。在病理改变方面以成纤维细胞增殖及大量ECM沉积为特征[2]。因此，寻找有效药物抑制肺成纤维细胞的过渡增生是防治肺纤维化的重要手段之一。《神农本草经》载黄芪，性微温，味甘，归脾、肺经，有补气升阳，益卫固表，托毒生肌，利水退肿之功效。黄芪用途广泛，可用于脾肺气虚或中气下陷之症，卫气虚所致表虚自汗，气血不足所致痈疽不溃或溃久不敛，浮肿尿少，气虚血滞所导致的肢体麻木、关节痹痛和气虚津亏的消渴等症。现代药理研究表明黄芪的主要化学成分有黄芪多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸等。本实验主要观察黄芪注射液对体外培养条件下的人胚肺成纤维细胞的生长增殖和胶原合成的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

人胚肺成纤维细胞（MRC-5）购置中国协和医科大学基础医学院细胞中心；MEM/NEAA培养液购置中国协和医科大学基础医学院；胰酶购于Sigma公司；胎牛血清购于Gibco公司；黄芪注射液购置成都地奥九泓制药厂，每支10 mL（相当于原生药材20 g）；0.1%天狼猩红苦味酸染液购置北京海德生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO）购置北京科海军舟有限公司；荧光倒置显微镜为日本尼康公司产品；生化培养箱，SANYO公司；酶标仪，为美国B.D公司产品。

1.2 细胞的培养

MRC-5细胞培养于含10%胎牛血清、100 µg/mL青霉素、100 µg/mL链霉素的MEM/NEAA培养液中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的CO2育箱中培养，96 h长满瓶底，3～4 d更换1次培养液，传代。

1.3 黄芪注射液对MRC-5增生的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的MRC-5，胰酶37 ℃消化5 min，以10%胎牛血清的MEM/NEAA培养液制备成1×105/mL细胞悬液，接种于96孔培养液板中，每孔200 µL，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养，至细胞长至单层后，分别在细胞中加入不同浓度的药物培养液，同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照，每组设10个复孔。分别继续培养24、48、72 h后，每孔加入20 µL MTT，继续培养4 h，弃上清液，加入200 µL DMSO，轻微震荡10 min，使MTT完全溶解，于自动酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度A值。

1.4 胶原的检测[3]

取对数生长期的成纤维细胞，用MEM/NEAA培养液调整细胞数为1×105/mL，接种到96孔培养板中，每孔200 µL，37 ℃、5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养，24 h后在各组细胞中加入含有不同浓度的药物培养液，另设不加药的正常对照组，每组设10个复孔。分别培养24、48、72 h后吸去培养液，每孔加甲醇100 µL，-20 ℃固定一夜，PBS洗1次，天狼猩红染1 h，0.1%醋酸洗3次，每孔加入0.1 µmol/L NaOH 20 µL，室温震荡1 h，置于酶标仪540 nm处检测。

2 结 果

2.1 黄芪注射液对体外培养人胚肺MRC-5细胞增殖的影响

见表1。MTT结果：黄芪注射液浓度为400 mg/mL时能显著抑制MRC-5生长（P＜0.05）。25～200 mg/mL的浓度范围对MRC-5的生长具有促进作用。说明黄芪注射液对人胚肺成纤维细胞的生长增殖既可促进又可以抑制，呈剂量依赖性。

表1 黄芪注射液对体外培养 MRC-5细胞生长的影响()

表1 黄芪注射液对体外培养 MRC-5细胞生长的影响()

注：与对照组相比较，P＜0.05

组别 剂量 A值24 h 48 h 72 h对照组 0 0.259±0.01 0.476±0.03 0.575±0.05实验组 25 0.275±0.03 0.524±0.02 0.675±0.02实验组 50 0.294±0.02 0.534±0.04 0.739±0.02实验组 100 0.325±0.02 0.554±0.03 0.745±0.03实验组 200 0.305±0.10 0.515±0.03 0.599±0.01实验组 400 0.236±0.05 0.355±0.01 0.373±0.02

2.2 镜下观察成纤维细胞形态的变化

对照组的细胞密度低时，细胞长梭形或三角形，有多个细胞质突起（图1）；细胞密度高时，以长梭形为主，排列紧密，呈放射状或涡旋状，边界不清（图2）。用药组的细胞：25～200 mg/mL浓度下的细胞形态与对照组差别不大，仅生长速度快于对照组；400 mg/mL浓度下的细胞数量明显减少，细胞皱缩，细胞边缘变钝，细胞间隙增宽，分布松散，甚至可以看到漂浮的死亡细胞（图3）。

2.3 胶原测定结果

随着黄芪注射液的浓度增加，与对照组相比，当浓度在25～200 mg/mL时，成纤维细胞的胶原生成量有所增加，而在400 mg/mL浓度时，成纤维细胞的胶原生成量明显减少。结果见表2。

图1 对照组细胞低密度照片

图2 对照组细胞高密度照片

图3 400 mg/mL浓度下细胞照片

表2 不同浓度的黄芪注射液对体外培养MRC-5细胞的ECM影响()

表2 不同浓度的黄芪注射液对体外培养MRC-5细胞的ECM影响()

注：与对照组相比较，P＜0.05

组别 剂量（mg/mL） 吸光度对照组 0 0.403±0.018黄芪注射液组 25 0.426±0.054黄芪注射液组 50 0.434±0.047黄芪注射液组 100 0.505±0.032黄芪注射液组 200 0.436±0.047黄芪注射液组 400 0.242±0.016

3 讨 论

肺纤维化是多种原因引起的慢性肺系疾病的共同结局，是多种肺系疾病发展到晚期的共同病理变化。其集中表现为成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积。在肺部，细胞外基质的主要成分之一胶原即来自于活化的成纤维细胞。由于成纤维细胞的异常增殖及胶原的分泌增加在肺纤维化过程中起着重要作用[4]，因此，抑制肺成纤维细胞增殖是防治肺纤维化的一种有效手段。

本实验以人胚肺成纤维细胞为靶细胞，研究黄芪注射液对成纤维细胞形态及胶原表达的影响。结果发现，黄芪注射液在中低浓度条件下对成纤维细胞的生长有促进作用，在高浓度条件下则有抑制作用。提示其可能有预防或延缓肺纤维化疾病进程的作用。有研究表明，在肺纤维化的发生发展过程中，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成与降解失衡起主要作用，在肺泡炎症阶段或肺纤维化早期主要以Ⅲ型胶原增加为主，此期病变尚可逆转，随后病变转为慢性，则以Ⅰ型胶原沉积为主，形成不可逆转的改变[5,6]。天狼腥红染液能与胶原紧密吸附，反应极其稳定，染色后不褪色，有特异性，是目前胶原染色最好的染料。在普通光镜下观察，胶原纤维呈红色。

综上所述，黄芪注射液在中低浓度下能够促进成纤维细胞的生长，高浓度下可以抑制成纤维细胞的生长，因此可以延缓肺纤维化的进程。同时提示黄芪对人体的作用具有双向性。

[1] ArauJo CC,Leon LL.Biological activities of Curcuma longal[J]. Meminst Oswald Cruz,2001,96(4):7232-7238.

[2] 陈珍旭,吴蓉易.葛根素对实验性大鼠肺纤维化影响[J].临床肺科杂志,2006,11(4):4232-4236.

[3] Brnton MH,Kopp JB.TGFβ-1 and Fibrosis[J].Microbes Infect,19 99,1(15):1349-1365.

[4] 赵洪文.肺成纤维细胞在肺纤维化中的作用[J].国外医学·呼吸系统分册,1996,16(3):116-117.

[5] 侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹参治疗大鼠肺纤维化对Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响[J].中华结核和呼吸杂志,1999,22(1):43-44.

[6] 何玉先,刘秉慈.实验性矽肺纤维化组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达[J].基础医学与临床,1994,14(6):43-46.

R28

B

1671-8194（2014）18-0086-02

国家自然基金资助项目（项目编号：81202787）

*通讯作者：E-mail： lydtry@sina．com