人参皂苷Rh2通过GATA-1诱导K562细胞红系分化作用的研究*

武 剑 王 炜 李 晓

（浙江省杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

人参皂苷Rh2通过GATA-1诱导K562细胞红系分化作用的研究*

武 剑 王 炜 李 晓

（浙江省杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006）

目的了解人参皂苷Rh2是否通过GATA-1蛋白诱导白血病细胞株K562的分化作用。方法利用凝胶集落生成实验检测不同浓度人参皂苷Rh2对白血病细胞株K562的增殖抑制作用；采用免疫细胞化学法和Western-blot法检测不同浓度人参皂苷Rh2处理前后K562细胞株中GATA-1蛋白表达情况。结果凝胶集落生成实验结果显示人参皂苷Rh2对K562细胞有明显的增殖抑制作用，且呈剂量依赖性；免疫细胞化学法和Western-blot法提示人参皂苷Rh2可诱导K562细胞内GATA-1表达，且呈剂量依赖性。结论人参皂苷Rh2可显著抑制白血病细胞株K562的生长，其作用呈浓度依赖性；人参皂苷Rh2在体外可通过上调GATA-1蛋白表达诱导K562向红系细胞方向分化。

人参皂苷Rh2 白血病 分化 GATA-1

研究认为人参皂苷Rh2可提升人体免疫力，刺激正常人红系和粒系祖细胞分化而促进血细胞生成［1］，但目前关于其机制的研究尚不十分明确。本课题旨在通过各种检测方法，在体外观察人参皂苷Rh2对白血病细胞株K562的红系分化作用并初探其机制，从而为人参皂苷Rh2临床使用提供更有利证据，也为白血病治疗寻找新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 K562细胞由本实验室保存，IMDM培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，GATA-1抗体、二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，β-actin抗体购自武汉博士德公司，人参皂苷Rh2购自浙江亚克药业有限公司。

1.2 细胞培养 将K562细胞常规培养于含15％小牛血清的IMDM培养基中，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 集落生成实验 计数细胞浓度为5×103/mL，分为10、20、40和80 mg/L 4个浓度为实验组，并以不加药为对照组，共5组分别进行细胞集落培养，做3个重复孔并重复3遍。于37℃、5％CO2的恒温箱中培养7 d后，以大于40个细胞的聚合为一个集落，观察计数每孔的集落数，并计算抑制率/％=（A对照组－A实验组）/A对照组×100％。

1.4 细胞免疫化学 5组细胞于恒温箱中培养7 d后，收集细胞并调整浓度为1×106/mL取100 μL，800 rpm离心5 min甩片。4％多聚甲醛固定15 min，PBS清洗标本3次，0.5％Triton X-100（DPBS配）孵育20 min，PBS清洗标本3次。GATA-1一抗孵育4℃过夜，用PBS液清洗标本3次，二抗37℃孵育30 min，PBS清洗标本3次各5min，DAB显色，蒸馏水洗2次，苏木素复染1min，自来水洗30 min，中性树胶封片。

1.5 Western-blot法检测K562细胞内GATA-1蛋白表达量 5组细胞于恒温箱中培养7d后，收集细胞并分别提取蛋白，Western-blot法检测各组GATA-1蛋白表达情况，以β-actin为内参。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rh2对K562细胞半固体集落生成的影响 见表1。使用不同剂量人参皂苷Rh2处理K562细胞7 d后，随着剂量的增加，人参皂苷Rh2对细胞增殖的抑制率升高，呈一定的剂量依赖关系。

表1 人参皂苷Rh2对K562细胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

表1 人参皂苷Rh2对K562细胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

与对照组比较，△P＜0.05。

组 别 人参皂苷Rh2（mg/L）集落数/103个细胞 抑制率（％）对照组 0141.0±4.3 0实验组1 10127.1±4.6△ 9.8±3.3△实验组2 20112.8±4.0△ 20.0±3.5△实验组3 4071.9±4.8△ 48.9±4.2△实验组4 8052.3±4.2△ 62.9±3.2△

2.2 人参皂苷Rh2对K562细胞中GATA-1蛋白表达的影响 见图1，图2。不同浓度人参皂苷Rh2处理K562细胞7d后，随着剂量的增加，细胞免疫化学及Western-blot法检测均显示人参皂苷 Rh2可诱导K562细胞GATA-1蛋白表达的增高，且呈一定剂量依赖性。

3 讨论

中医学认为白血病是由于“邪毒”侵入营血，攻注骨髓、肝、肾，从而使阴阳失衡，骨髓造血功能障碍而发病［2］。中医对白血病的治疗主要是调理阴阳，使肝、脾、肾等器官功能得到恢复，同时可促进幼稚细胞凋亡、诱导其分化等作用，使骨髓造血功能重新启动，以达到阴阳平衡，使白血病患者达到康复。人参作为抗衰老、强壮剂和补气血药物已有千余年的应用历史，有关人参皂苷可以调节肿瘤细胞的生长代谢，促进肿瘤细胞分化，诱导细胞凋亡的研究已成为近年来国内外研究的热点［3-4］。

人白血病细胞株K562是急性髓系白血病细胞，在诱导因素作用下可向多系分化，它与人多向造血祖细胞的生物学特点相似，是研究细胞分化的理想模型。本实验以K562细胞株为研究对象，观察人参皂苷Rh2对K562细胞的增殖抑制及诱导分化作用，并初步探索其机制。结果显示人参皂苷Rh2对K562细胞的增殖抑制作用具有剂量依赖性，随着剂量的增加，抑制作用增强。在诱导红系分化方面，添加不同剂量的人参皂苷Rh2可明显提高K562细胞红系特异性核转录因子GATA-1蛋白的表达，提示人参皂苷Rh2可能具有诱导红系分化的作用，从而为人参皂苷Rh2今后的临床应用提供理论基础。

图1 细胞免疫化学法检测人参皂苷Rh2对K562细胞中GATA-1蛋白表达的作用（×1000）

图2 蛋白免疫印迹法检测人参皂苷Rh2对K562细胞中GATA-1表达

［1］姚云，陈雪松，赵英佒，等.人参皂苷Rh2调节白血病细胞增殖分化的作用［J］.解剖学杂志，2011，34（4）：469-472.

［2］何南，姚晶，潘小涛，等.白血病的中药治疗［J］.吉林医药学院学报，2011，32（3）：171-173.

［3］黄莉，黄纯兰.威灵仙总皂苷诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4分化作用的研究［J］.中国中医急症，2012，21（8）：1248-1250.

［4］Yi JS，Choo HJ，Cho BR，et al.Ginsenoside Rh2 induces ligand-independent Fas activation via lipid raft disruption［J］. Biochem Biophy Res Comm，2009，385（2）：154-159.

Effect of Ginsenoside Rh2 on Inducing Erythroid Differentiation of K562 Cells through GATA-1

WU Jian，WANG Wei，LI Xiao.Hangzhou First People's Hospital，Zhejiang，Hangzhou 310006，China

Objective：To investigate whether the ginsenoside Rh2 could induce the differentiation of K562 cells through GATA-1.Methods：K562 cells were treated with different concentrations of ginsenoside Rh2.Gel colony forming experiment was used to detect the proliferation.Immunocytochemical and Western-blot were used to detect the expression of GATA-1 in K562 cells.Results：Ginsenoside Rh2 could significantly inhibit proliferation and enhance expression of GATA-1 in K562.Conclusion：Ginsenoside Rh2 can significantly inhibit the growth of K562 and induce its erythroid differentiations.

Ginsenoside Rh2；Leukemia；Differentiation；GATA-1

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1451-02

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.021

2014-04-23）

浙江省杭州市医药卫生计划项目（2012B005）