蓖麻细胞悬浮培养技术研究
2014-05-04康薇郑进
康薇++郑进
摘要：生长在大冶市铜绿山矿区的野生蓖麻（Ricinus communis L.）是一种新发现的铜超富集植物。为了建立稳定、快速生长的蓖麻悬浮细胞系，以便筛选重金属抗性蓖麻细胞和培育超富集植株，以前期诱导的蓖麻胚性愈伤组织为材料，通过正交试验设计，优化悬浮细胞系的培养条件，建立蓖麻细胞悬浮系，并在优化条件下测定细胞的生长曲线和培养液pH变化。结果表明，
关键词：蓖麻（Ricinus communis L.）；胚性愈伤组织；正交试验设计；悬浮细胞系
中图分类号：S565.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0932-04
The Cell Suspension Culture of Ricinus communis L.
KANG Wei1，ZHENG Jin1，2
（1.Hubei Polytechnic of University，Huangshi 435003， Hubei，China；2.Hubei Key Laboratory of Mine Environmental Pollution Control &Remediation，Huangshi 435003， Hubei，China）
Abstract： Ricinus communis was a new hyperaccumulator growing on Tonglushan copper mine in Daye city. A stable and rapid growth cell suspension culture line of R. communis was established to screen heavy-resistance cell and accumulate plants using embyrogenic cellus with orthogonal experimental design. The results showed that the optimal culturing conditions were MS medium with 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 50 mg/L sucrose + 350 mg/L casein hydrolyzate and 2.0 g（FW）/50 mL inoculation quantity，culture temperature （26±2）℃，drak culture，110 r/min. The best growth rate of the cells were 4.58 g/（50 mL·14 d） and 0.49 g/（50 mL·16 d） under the optimal conditions， respectively. The growing curves of R. communis suspension cell shaped by “S” nearly. The cultutring period was 16 d with the rapid growth phase from 6 to 14 d. The pH trend of culture liquid was declined first and then increased to stable gradually during a culturing period.
Key words： Ricinus communis L.； embyrogenic cellus； orthogonal experimental design； suspension cell line
蓖麻（Ricinus communis L.）属于大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻属（Ricinus），在我国各地均有分布，是一种常见的特种油料作物，经济价值较高[1]。近年来，蓖麻在植物修复重金属污染环境方面的作用引起人们的关注。研究报道在液体培养和盆栽条件下，蓖麻幼苗对水体和土壤铜的吸收都达到超富集水平[2，3]；蓖麻在重度锌污染的土壤中仍然生长较好，表现出较强的耐受性[4，5]；蓖麻叶片可吸收大气中的二氧化硫、二氧化碳，通过种植蓖麻可以减轻大气污染[6]。笔者前期研究证实，在大冶市铜绿山矿区自然散生的野生蓖麻，不仅对土壤铜污染具有较强的耐受性，而且体内能够富集较多的铜，具有铜超积累植物的特征，在修复铜污染土壤中具有较大的潜力[7，8]。但是，由于长期处在重金属污染严重的土壤环境下，与栽培蓖麻的农艺性状相比，这些矿山蓖麻大多株形偏小，结实率低，子粒较小，制约了蓖麻在植物修复工程中的应用，需要通过遗传改良加以克服。目前，生物技术在植物育种中的应用十分广泛，通过生物技术与传统育种的结合，不仅克服了传统杂交育种周期较长、效率较低的不足，而且大大提高了育种效率，成为农业科技创新的重要战略[9]。本研究以前期诱导的蓖麻胚性愈伤组织为材料，采用细胞悬浮培养法建立蓖麻悬浮细胞系，为筛选重金属抗性蓖麻细胞和培育超富集植株提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用蓖麻胚性愈伤组织由湖北理工学院生物工程实验室用蓖麻种胚诱导培养获得[10]。
1.2 培养基和培养条件
1.3 试验设计方案
采用正交试验设计优化悬浮细胞培养条件，因素与水平见表1。在优化培养条件下，用150 mL三角瓶悬浮培养蓖麻细胞，每瓶50 mL液体培养基，接种2.0 g 愈伤组织，每隔7 d继代1次，连续继代7～10次，即可获得悬浮细胞。前3次继代时，弃去上清液的1/2并补充等量的新鲜培养基，之后继代时，将培养物摇匀并稍静置后，取10 mL培养物接种继代。
1.4 悬浮细胞生长曲线和pH的测定
2 结果与分析
2.1 蓖麻胚性愈伤组织继代培养
2.3 细胞悬浮培养的生长曲线
2.4 培养液pH的变化
由图7可知，在细胞悬浮培养的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，从第七天开始，pH逐渐升高，培养至第18天，pH上升至5.76，之后，基本维持在这个水平。可见，蓖麻细胞悬浮培养过程中，培养液pH表现为先降低后升高，然后趋于稳定，这可能与培养基化学成分的消耗和培养细胞分泌的酸性或碱性物质有关[12]。
3 小结与讨论
参考文献：
[1] 严兴初.蓖麻种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2007.
[2] 渠荣遴，李德森，杜荣骞，等.水体重金属污染的植物修复研究（Ⅳ）[J].农业环境科学学报，2003，22（2）：167-169.
[3] 张 威，马汐平，尚德隆，等.苗期植物对土壤中重金属吸附的研究[J].辽宁大学学报（自然科学版），2004，31（2）：180-183.
[4] 谭贵娥，何池全，陆晓怡.外源微生物强化蓖麻对铅的吸收与积累研究[J].农业环境科学学报，2008，27（1）：82-85.
[5] 陆晓怡，何池全.蓖麻对重金属Cd的耐性与吸收积累研究[J]. 农业环境科学学报，2005，24（4）：674-677.
[6] 董 钻， 沈秀瑛. 作物栽培学总论[M].北京：中国农业出版社， 2000.
[7] 郑 进，康 薇.湖北铜绿山古铜矿野生蓖麻重金属含量研究[J].黄石理工学院学报，2009，25（1）：36-40.
[8] 康 薇，郑 进.蓖麻——一种新的铜超积累植物[J].安徽农业科学，2011，39（3）：1449-1451，1466.
[9] 杨二波，李龙朋，王帅溥，等.生物育种的现状及发展趋势[J].河南农业，2012，7（1）：6-7.
[10] 金 勇，郑 进，康 薇，等.蓖麻愈伤组织的诱导及其耐铜性研究[A].中国土壤学会.《面向未来的土壤科学（中册）——中国土壤学会第十二次会员代表大会暨第九届海峡两岸土壤肥料学术交流研讨会论文集》[C].成都：电子科技大学出版社，2012.
[11] 杜荣骞.生物统计学[M].第二版.北京：高等教育出版社，2003.
[12] 周晓鹿，李思良.皂质芦荟细胞悬浮培养初探[J].北方园艺，2008（2）：188-192.
1.4 悬浮细胞生长曲线和pH的测定
2 结果与分析
2.1 蓖麻胚性愈伤组织继代培养
2.3 细胞悬浮培养的生长曲线
2.4 培养液pH的变化
由图7可知，在细胞悬浮培养的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，从第七天开始，pH逐渐升高，培养至第18天，pH上升至5.76，之后，基本维持在这个水平。可见，蓖麻细胞悬浮培养过程中，培养液pH表现为先降低后升高，然后趋于稳定，这可能与培养基化学成分的消耗和培养细胞分泌的酸性或碱性物质有关[12]。
3 小结与讨论
参考文献：
[1] 严兴初.蓖麻种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2007.
[2] 渠荣遴，李德森，杜荣骞，等.水体重金属污染的植物修复研究（Ⅳ）[J].农业环境科学学报，2003，22（2）：167-169.
[3] 张 威，马汐平，尚德隆，等.苗期植物对土壤中重金属吸附的研究[J].辽宁大学学报（自然科学版），2004，31（2）：180-183.
[4] 谭贵娥，何池全，陆晓怡.外源微生物强化蓖麻对铅的吸收与积累研究[J].农业环境科学学报，2008，27（1）：82-85.
[5] 陆晓怡，何池全.蓖麻对重金属Cd的耐性与吸收积累研究[J]. 农业环境科学学报，2005，24（4）：674-677.
[6] 董 钻， 沈秀瑛. 作物栽培学总论[M].北京：中国农业出版社， 2000.
[7] 郑 进，康 薇.湖北铜绿山古铜矿野生蓖麻重金属含量研究[J].黄石理工学院学报，2009，25（1）：36-40.
[8] 康 薇，郑 进.蓖麻——一种新的铜超积累植物[J].安徽农业科学，2011，39（3）：1449-1451，1466.
[9] 杨二波，李龙朋，王帅溥，等.生物育种的现状及发展趋势[J].河南农业，2012，7（1）：6-7.
[10] 金 勇，郑 进，康 薇，等.蓖麻愈伤组织的诱导及其耐铜性研究[A].中国土壤学会.《面向未来的土壤科学（中册）——中国土壤学会第十二次会员代表大会暨第九届海峡两岸土壤肥料学术交流研讨会论文集》[C].成都：电子科技大学出版社，2012.
[11] 杜荣骞.生物统计学[M].第二版.北京：高等教育出版社，2003.
[12] 周晓鹿，李思良.皂质芦荟细胞悬浮培养初探[J].北方园艺，2008（2）：188-192.
1.4 悬浮细胞生长曲线和pH的测定
2 结果与分析
2.1 蓖麻胚性愈伤组织继代培养
2.3 细胞悬浮培养的生长曲线
2.4 培养液pH的变化
由图7可知，在细胞悬浮培养的前6 d，pH由起始的5.80下降到4.35，从第七天开始，pH逐渐升高，培养至第18天，pH上升至5.76，之后，基本维持在这个水平。可见，蓖麻细胞悬浮培养过程中，培养液pH表现为先降低后升高，然后趋于稳定，这可能与培养基化学成分的消耗和培养细胞分泌的酸性或碱性物质有关[12]。
3 小结与讨论
参考文献：
[1] 严兴初.蓖麻种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2007.
[2] 渠荣遴，李德森，杜荣骞，等.水体重金属污染的植物修复研究（Ⅳ）[J].农业环境科学学报，2003，22（2）：167-169.
[3] 张 威，马汐平，尚德隆，等.苗期植物对土壤中重金属吸附的研究[J].辽宁大学学报（自然科学版），2004，31（2）：180-183.
[4] 谭贵娥，何池全，陆晓怡.外源微生物强化蓖麻对铅的吸收与积累研究[J].农业环境科学学报，2008，27（1）：82-85.
[5] 陆晓怡，何池全.蓖麻对重金属Cd的耐性与吸收积累研究[J]. 农业环境科学学报，2005，24（4）：674-677.
[6] 董 钻， 沈秀瑛. 作物栽培学总论[M].北京：中国农业出版社， 2000.
[7] 郑 进，康 薇.湖北铜绿山古铜矿野生蓖麻重金属含量研究[J].黄石理工学院学报，2009，25（1）：36-40.
[8] 康 薇，郑 进.蓖麻——一种新的铜超积累植物[J].安徽农业科学，2011，39（3）：1449-1451，1466.
[9] 杨二波，李龙朋，王帅溥，等.生物育种的现状及发展趋势[J].河南农业，2012，7（1）：6-7.
[10] 金 勇，郑 进，康 薇，等.蓖麻愈伤组织的诱导及其耐铜性研究[A].中国土壤学会.《面向未来的土壤科学（中册）——中国土壤学会第十二次会员代表大会暨第九届海峡两岸土壤肥料学术交流研讨会论文集》[C].成都：电子科技大学出版社，2012.
[11] 杜荣骞.生物统计学[M].第二版.北京：高等教育出版社，2003.
[12] 周晓鹿，李思良.皂质芦荟细胞悬浮培养初探[J].北方园艺，2008（2）：188-192.
