赞皇大枣黑腐病菌拮抗菌的室内多重筛选及发酵条件优化

李静虹等

摘要：以赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）黑腐病主要病原菌茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对分离自土壤中的10株芽孢杆菌（Bacillus spp.）菌株进行室内多重筛选，并通过单因素试验对筛选获得的目标菌进行发酵培养基和发酵条件优化。结果表明，芽孢杆菌菌株B01对靶标菌有明显而稳定的拮抗效果；其最佳发酵培养基配方为蔗糖

中图分类：S476；S436.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0809-05

In vitro Multiple Screening of Antagonistic Bacillus against Phoma sp. and Optimizing Its Fermentation Factors

LI Jing-hong，GAO Fen，WANG Jun-hong，WANG Meng-liang

（Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006，China）

赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）又名金丝大枣，是中国700多个枣品种中惟一的自然三倍体[1]，整齐个大、皮薄肉厚、可食率高、营养丰富，是天然的营养保健食品，具有较高的商品价值[2]。黑腐病是赞皇大枣主要果实病害之一，近几年来该病害发生日趋严重，一般年份病果率20%～30%，流行年份可达50%以上， 甚至可使枣果绝收[3]，极大地影响了赞皇大枣的产量、果实品质和商品价值。

赞皇大枣作为鲜食加工兼用品种，对防治果实病害的农药使用具有较高的要求。生物农药相对于化学农药具有对环境、生态友好，对人类安全、无毒等优点，得到了广泛重视并发挥着越来越重要的作用，其中多种有益微生物及其代谢产物已成功应用于植物病害的生物防治中，取得了较好的经济和社会效益[4]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GBO3（美国）、A213（澳大利亚）、RB-14（日本）、B916（中国）、B908（中国）等具有优良性状的菌株已经应用于生产实践[5]；蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株BC98-I[6]发酵液与菌丝粗提物对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）具有良好抑制作用，可降低孢子萌发率，使菌丝生长形态异常，且抑菌特性稳定，对外界环境有很强的适应力和耐受性。目前有关枣黑腐病的生物防治报道较少，陈贻金等[7]将农用链霉素（70～140 IU/mL）、DT（50%， 600倍稀释液）、卡那霉素（140 IU/mL）和土霉素（210 IU/mL）等在枣黑腐病发病期内混合使用，保果率在90% 以上；李志清等[8]将3%中生菌素（800倍稀释液）、4%农抗120（400倍稀释液）和4%双抗（400倍稀释液）等与化学农药甲基托布津等交替使用，防治枣黑腐病效果也较好，但利用芽孢杆菌（Bacillus spp.）开发防治枣黑腐病生防制剂的研究鲜见报道。为寻找枣果实病害无公害防治的新途径，本研究以茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对前期自土壤中分离获得的10株具抗真菌活性的芽孢杆菌菌株进行了室内多重筛选和发酵培养基及发酵条件优化试验，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 靶标菌 赞皇大枣黑腐病主要病原菌茎点霉菌，从山西省石楼县患赞皇大枣黑腐病的病果中分离获得，由山西大学应用化学研究所实验室分离鉴定。

1.2 拮抗芽孢杆菌的多重筛选

1.2.1 病原菌培养

芽孢杆菌属细菌，因具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优点[13]而备受关注。一些芽孢杆菌菌株已经开发成生物农药投入到植物病害的防治中。本研究筛选获得的芽孢杆菌B01虽然在室内筛选中表现出了良好的抑菌效果，具有作为生物农药的潜力，但还需对其田间效果作进一步试验研究。此外，还需对该菌株进行鉴定及抑菌有效组分分离、理化性质测定、剂型研制、安全性试验等方面的研究工作，为开发具有实际应用价值的生物农药奠定基础。

参考文献：

[1] 及 华，关军锋，窦世娟，等.采后赞皇大枣不同包装处理的生理生化性状差异[J].果树学报，2004，21（6）：540-543.

[2] 赵丛枝. 赞皇大枣采后生理及其贮藏技术研究[D].河北保定： 河北农业大学，2004.

[3] 李志清，常聚普，程国华，等.枣黑腐病防治技术研究[J].林业科技通讯，2000（12）：10-12.

[4] 张丽萍，张贵云.微生物农药研究进展[J].北京农业科学，2000（4）：22-24.

[5] 李 明，双 宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

[6] 高 芬，马利平，乔雄梧，等.蜡质芽孢杆菌BC98-I发酵液与粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性研究[J].中国生态农业学报， 2006，14（1）：189-192.

[7] 陈贻金，陈谟林，朱林元.枣缩果病及其防治技术研究[J].林业科技通讯，1989（8）：3-7.

[8] 李志清，张兆欣，田国忠，等.枣黑腐病田间药剂防治技术研究[J].中国森林病虫，2005（5）：3-6.

[9] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2001.

[10] 林福呈，李德葆.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S9对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33（2）：174-177.

[11] 董金甫，李瑶卿.茶多酚抑菌作用的研究[J].茶叶，1992（3）：46-49.

[12] 沈光斌，周明国.水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性监测[J].植物保护，2002，28（1）：9-11.

[13] 朱玥妍，刘 姣，杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（34）：16635-16638.

摘要：以赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）黑腐病主要病原菌茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对分离自土壤中的10株芽孢杆菌（Bacillus spp.）菌株进行室内多重筛选，并通过单因素试验对筛选获得的目标菌进行发酵培养基和发酵条件优化。结果表明，芽孢杆菌菌株B01对靶标菌有明显而稳定的拮抗效果；其最佳发酵培养基配方为蔗糖

中图分类：S476；S436.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0809-05

In vitro Multiple Screening of Antagonistic Bacillus against Phoma sp. and Optimizing Its Fermentation Factors

LI Jing-hong，GAO Fen，WANG Jun-hong，WANG Meng-liang

（Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006，China）

赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）又名金丝大枣，是中国700多个枣品种中惟一的自然三倍体[1]，整齐个大、皮薄肉厚、可食率高、营养丰富，是天然的营养保健食品，具有较高的商品价值[2]。黑腐病是赞皇大枣主要果实病害之一，近几年来该病害发生日趋严重，一般年份病果率20%～30%，流行年份可达50%以上， 甚至可使枣果绝收[3]，极大地影响了赞皇大枣的产量、果实品质和商品价值。

赞皇大枣作为鲜食加工兼用品种，对防治果实病害的农药使用具有较高的要求。生物农药相对于化学农药具有对环境、生态友好，对人类安全、无毒等优点，得到了广泛重视并发挥着越来越重要的作用，其中多种有益微生物及其代谢产物已成功应用于植物病害的生物防治中，取得了较好的经济和社会效益[4]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GBO3（美国）、A213（澳大利亚）、RB-14（日本）、B916（中国）、B908（中国）等具有优良性状的菌株已经应用于生产实践[5]；蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株BC98-I[6]发酵液与菌丝粗提物对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）具有良好抑制作用，可降低孢子萌发率，使菌丝生长形态异常，且抑菌特性稳定，对外界环境有很强的适应力和耐受性。目前有关枣黑腐病的生物防治报道较少，陈贻金等[7]将农用链霉素（70～140 IU/mL）、DT（50%， 600倍稀释液）、卡那霉素（140 IU/mL）和土霉素（210 IU/mL）等在枣黑腐病发病期内混合使用，保果率在90% 以上；李志清等[8]将3%中生菌素（800倍稀释液）、4%农抗120（400倍稀释液）和4%双抗（400倍稀释液）等与化学农药甲基托布津等交替使用，防治枣黑腐病效果也较好，但利用芽孢杆菌（Bacillus spp.）开发防治枣黑腐病生防制剂的研究鲜见报道。为寻找枣果实病害无公害防治的新途径，本研究以茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对前期自土壤中分离获得的10株具抗真菌活性的芽孢杆菌菌株进行了室内多重筛选和发酵培养基及发酵条件优化试验，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 靶标菌 赞皇大枣黑腐病主要病原菌茎点霉菌，从山西省石楼县患赞皇大枣黑腐病的病果中分离获得，由山西大学应用化学研究所实验室分离鉴定。

1.2 拮抗芽孢杆菌的多重筛选

1.2.1 病原菌培养

芽孢杆菌属细菌，因具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优点[13]而备受关注。一些芽孢杆菌菌株已经开发成生物农药投入到植物病害的防治中。本研究筛选获得的芽孢杆菌B01虽然在室内筛选中表现出了良好的抑菌效果，具有作为生物农药的潜力，但还需对其田间效果作进一步试验研究。此外，还需对该菌株进行鉴定及抑菌有效组分分离、理化性质测定、剂型研制、安全性试验等方面的研究工作，为开发具有实际应用价值的生物农药奠定基础。

参考文献：

[1] 及 华，关军锋，窦世娟，等.采后赞皇大枣不同包装处理的生理生化性状差异[J].果树学报，2004，21（6）：540-543.

[2] 赵丛枝. 赞皇大枣采后生理及其贮藏技术研究[D].河北保定： 河北农业大学，2004.

[3] 李志清，常聚普，程国华，等.枣黑腐病防治技术研究[J].林业科技通讯，2000（12）：10-12.

[4] 张丽萍，张贵云.微生物农药研究进展[J].北京农业科学，2000（4）：22-24.

[5] 李 明，双 宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

[6] 高 芬，马利平，乔雄梧，等.蜡质芽孢杆菌BC98-I发酵液与粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性研究[J].中国生态农业学报， 2006，14（1）：189-192.

[7] 陈贻金，陈谟林，朱林元.枣缩果病及其防治技术研究[J].林业科技通讯，1989（8）：3-7.

[8] 李志清，张兆欣，田国忠，等.枣黑腐病田间药剂防治技术研究[J].中国森林病虫，2005（5）：3-6.

[9] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2001.

[10] 林福呈，李德葆.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S9对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33（2）：174-177.

[11] 董金甫，李瑶卿.茶多酚抑菌作用的研究[J].茶叶，1992（3）：46-49.

[12] 沈光斌，周明国.水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性监测[J].植物保护，2002，28（1）：9-11.

[13] 朱玥妍，刘 姣，杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（34）：16635-16638.

摘要：以赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）黑腐病主要病原菌茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对分离自土壤中的10株芽孢杆菌（Bacillus spp.）菌株进行室内多重筛选，并通过单因素试验对筛选获得的目标菌进行发酵培养基和发酵条件优化。结果表明，芽孢杆菌菌株B01对靶标菌有明显而稳定的拮抗效果；其最佳发酵培养基配方为蔗糖

中图分类：S476；S436.65 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）04-0809-05

In vitro Multiple Screening of Antagonistic Bacillus against Phoma sp. and Optimizing Its Fermentation Factors

LI Jing-hong，GAO Fen，WANG Jun-hong，WANG Meng-liang

（Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006，China）

赞皇大枣（Ziziphus jujuba ‘Zanhuang Dazao）又名金丝大枣，是中国700多个枣品种中惟一的自然三倍体[1]，整齐个大、皮薄肉厚、可食率高、营养丰富，是天然的营养保健食品，具有较高的商品价值[2]。黑腐病是赞皇大枣主要果实病害之一，近几年来该病害发生日趋严重，一般年份病果率20%～30%，流行年份可达50%以上， 甚至可使枣果绝收[3]，极大地影响了赞皇大枣的产量、果实品质和商品价值。

赞皇大枣作为鲜食加工兼用品种，对防治果实病害的农药使用具有较高的要求。生物农药相对于化学农药具有对环境、生态友好，对人类安全、无毒等优点，得到了广泛重视并发挥着越来越重要的作用，其中多种有益微生物及其代谢产物已成功应用于植物病害的生物防治中，取得了较好的经济和社会效益[4]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GBO3（美国）、A213（澳大利亚）、RB-14（日本）、B916（中国）、B908（中国）等具有优良性状的菌株已经应用于生产实践[5]；蜡质芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌株BC98-I[6]发酵液与菌丝粗提物对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）具有良好抑制作用，可降低孢子萌发率，使菌丝生长形态异常，且抑菌特性稳定，对外界环境有很强的适应力和耐受性。目前有关枣黑腐病的生物防治报道较少，陈贻金等[7]将农用链霉素（70～140 IU/mL）、DT（50%， 600倍稀释液）、卡那霉素（140 IU/mL）和土霉素（210 IU/mL）等在枣黑腐病发病期内混合使用，保果率在90% 以上；李志清等[8]将3%中生菌素（800倍稀释液）、4%农抗120（400倍稀释液）和4%双抗（400倍稀释液）等与化学农药甲基托布津等交替使用，防治枣黑腐病效果也较好，但利用芽孢杆菌（Bacillus spp.）开发防治枣黑腐病生防制剂的研究鲜见报道。为寻找枣果实病害无公害防治的新途径，本研究以茎点霉菌（Phoma sp.）为靶标，对前期自土壤中分离获得的10株具抗真菌活性的芽孢杆菌菌株进行了室内多重筛选和发酵培养基及发酵条件优化试验，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 靶标菌 赞皇大枣黑腐病主要病原菌茎点霉菌，从山西省石楼县患赞皇大枣黑腐病的病果中分离获得，由山西大学应用化学研究所实验室分离鉴定。

1.2 拮抗芽孢杆菌的多重筛选

1.2.1 病原菌培养

芽孢杆菌属细菌，因具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优点[13]而备受关注。一些芽孢杆菌菌株已经开发成生物农药投入到植物病害的防治中。本研究筛选获得的芽孢杆菌B01虽然在室内筛选中表现出了良好的抑菌效果，具有作为生物农药的潜力，但还需对其田间效果作进一步试验研究。此外，还需对该菌株进行鉴定及抑菌有效组分分离、理化性质测定、剂型研制、安全性试验等方面的研究工作，为开发具有实际应用价值的生物农药奠定基础。

参考文献：

[1] 及 华，关军锋，窦世娟，等.采后赞皇大枣不同包装处理的生理生化性状差异[J].果树学报，2004，21（6）：540-543.

[2] 赵丛枝. 赞皇大枣采后生理及其贮藏技术研究[D].河北保定： 河北农业大学，2004.

[3] 李志清，常聚普，程国华，等.枣黑腐病防治技术研究[J].林业科技通讯，2000（12）：10-12.

[4] 张丽萍，张贵云.微生物农药研究进展[J].北京农业科学，2000（4）：22-24.

[5] 李 明，双 宝，李海涛，等.枯草芽孢杆菌的研究与应用[J].东北农业大学学报，2009，40（9）：111-114.

[6] 高 芬，马利平，乔雄梧，等.蜡质芽孢杆菌BC98-I发酵液与粗提物对黄瓜枯萎病菌的抑菌特性研究[J].中国生态农业学报， 2006，14（1）：189-192.

[7] 陈贻金，陈谟林，朱林元.枣缩果病及其防治技术研究[J].林业科技通讯，1989（8）：3-7.

[8] 李志清，张兆欣，田国忠，等.枣黑腐病田间药剂防治技术研究[J].中国森林病虫，2005（5）：3-6.

[9] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2001.

[10] 林福呈，李德葆.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S9对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33（2）：174-177.

[11] 董金甫，李瑶卿.茶多酚抑菌作用的研究[J].茶叶，1992（3）：46-49.

[12] 沈光斌，周明国.水稻白叶枯病菌对噻枯唑的抗药性监测[J].植物保护，2002，28（1）：9-11.

[13] 朱玥妍，刘 姣，杜春梅.芽孢杆菌生物防治植物病害研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（34）：16635-16638.