表面增强拉曼光谱检测系统在实验教学中的应用

吴宝平，曲 典，王 燕，陶 蔷，刘文艳，满梓焱

（首都医科大学 生物医学工程学院，北京 100069）

为了充分发挥科研仪器的功能和使用率，提高教学质量和科研水平，很多学校都在探讨将科研仪器设备与本科实验教学相结合的方法［1－3］。随着科学技术的发展，新的检测技术逐步应用于临床诊断和治疗，医学院校的学生需要掌握这些技术和手段。因此将一些科研成果转化为具体的实验内容不仅可以培养学生的创新思维能力，而且能提高高校科研仪器的利用率，无疑是一个非常值得探索和研究的课题。本文以表面增强拉曼光谱（surface－enhanced Raman spectroscopy，SERS）检测技术为例，设计了一些适合本科生的创新性研究实验，使学生能在基础学习阶段就能开展带有课题研究性质的实验，提高科研工作能力和科学素养。

1 表面增强拉曼光谱检测技术在癌症早期诊断中的应用

拉曼散射是一种分子受光子激发的非弹性散射现象，拉曼光谱表征了化学物质的分子结构特性，成为识别鉴定未知化学物的有效方法。随着光学、电子学和半导体技术的发展，拉曼光谱技术的潜力得以充分展示。近年来，纳米技术的进步及应用给拉曼光谱提供了更多的应用领域。实验表明，拉曼光谱检测灵敏度随基底表面纳米颗粒尺度减小而增强，尤其在基底表面纳米颗粒尺度小于100nm情况下，检测灵敏度的增强效应尤为显著［4］。

本实验室是医学院校生物医学工程专业的科研实验室，所采用的拉曼光谱检测系统为RamTracer－200便携式表面增强拉曼检测系统，如图1所示。该系统应用现代纳米技术对基底进行表面处理，大大提高了检测灵敏度和精度，检测限提高了4～10个数量级，实现了对痕量被检物的测量［5］。近5年来，实验室采用此拉曼光谱检测系统，并结合相应的数据处理方法，在利用唾液进行癌症早期的检测技术取得了大量的研究成果，并有望应用于临床的早期诊断［6－8］。图2为正常人和肺癌患者唾液的SERS平均光谱图，图中可以发现拉曼光谱数据量大，两组峰重合度很高，不易于直接分辨，分别采用支持向量机算法和随机森林算法进行分类研究，得到了较好的分类效果［9］。

图1 RamTracer－200便携式表面增强拉曼检测系统

图2 肺癌患者与健康人唾液的平均拉曼光谱图

2 本科生实验教学的设计

上述研究成果表明，拉曼光谱检测技术在癌症早期诊断中将有很好的应用，但除了需掌握拉曼光谱仪的实验方法外，还需要进一步对统计学以及信号处理方面的深入研究工作，这对于刚刚进入大学学习的本科生，尤其是基础医学专业的学生有一定的难度。

本实验室的拉曼光谱检测系统属于便携式检测系统，结构简单清晰，便于学生了解实验装置的组成和工作原理，同时配合纳米芯片可完成固体、液体材质的样品检测。本文根据拉曼光谱检测系统的特点，设计了一组适合于低年级学生的入门实验。用于本科生第二课堂和七年制科研训练小组的学习和研究。

2.1 拉曼光谱认识实验

认识实验的目的是使学生学习拉曼光谱光谱仪的使用，同时掌握拉曼光谱仪的检测原理。

2.1.1 认识实验前的准备

由于不是传统型教学实验，我们把认识实验分成了两部分：见习观摩和认识实验。见习观摩主要是在研究生进行实验时，让参与项目的本科生观摩实验过程，包括实验数据处理过程。这一阶段要求见习的本科生了解拉曼光谱检测系统的结构和检测步骤。

观摩实验后，要求学生查阅文献，进一步了解拉曼光谱检测技术在各个领域的应用，指导学生选择认识实验的样品。

2.1.2 认识实验样品的选择

认识实验的样品应具有易于引起学生学习兴趣和实验结果易于分析处理的特点。学生在查阅文献后，发现拉曼光谱不仅在医学研究中有越来越广泛的应用，在食品安全、宝石鉴定中都有很好的应用。结合学生的兴趣和实验结果处理的难易程度，最后确定认识实验的样品为相对价值较低的市售水晶制品。

2.1.3 认识实验的过程控制

认识实验以掌握实验仪器使用方法为主，因此实验过程的控制尤为重要。拉曼光谱的实验首先要进行乙腈校正，然后还要进行显微聚焦和功率的选择。为了说明上述问题，在实验过程中，指导学生在同一样品上，选取不同的位置和不同的功率观察实验数据，分析功率变化对实验结果的影响。

2.2 拉曼光谱的应用实验

应用实验的设计侧重于基于检测系统自带软件的数据后处理过程。

2.2.1 应用实验样品的选择

由于在后期的实验中会涉及到血清、唾液等生物样品的检测，同时前期学生文献调研后对食品安全方面的研究比较感兴趣，因此应用实验的样品选用了不同材质的食用油，比如市售菜籽油和橄榄油。

2.2.2 应用实验的数据处理

实验数据处理采用RamTracer－200便携式表面增强拉曼检测系统自带的处理软件，主要包括基线处理和归一化处理两部分。在软件讲解中，对基线处理和归一化在研究工作中的作用也作相应的介绍，使学生对于科研工作方法有更深入的了解。在这部分实验中要求学生掌握基线处理和归一化处理的方法，并对所测数据进行处理和分析。由于使用实验中的数据进行处理是实验的主要内容，在要求学生分析结果时也要指导学生对整个实验过程进行分析，研究实验数据的合理性和科学性。

2.3 拉曼光谱的科研实验

上述2个实验主要是针对本科基础医学专业低年级学生开展的实验，侧重于培养学习兴趣，锻炼动手能力。对于七年制临床医学专业和生物医学工程专业的高年级学生则根据实验室研究工作进展情况，安排他们参与实验室的科研实验。

2.3.1 生物样品的采集和制备

本实验室主要检测的是唾液、血清等生物样品，这些样品的采集和制备都有严格的要求［5］。实验前的样品准备是实验成败的关键。前期样本采集需要在临床医院进行，学生需要去医院监督采集过程的规范性并整理病人的病历。在实验室，样本需要经过离心处理后，取上清液到纳米芯片上进行实验。

为了便于学生分析处理，特意设计了对吸烟人群的拉曼光谱分析实验，学生分别采集不吸烟、少量吸烟和大量吸烟的人群的唾液作为样本进行实验，并于前期实验室关于吸毒/戒毒数据［10］进行对比分析。

2.3.2 实验结果的分析

获得实验数据并进行初步的去基线、归一化处理后，将进行数据分析。目前实验室主要采用的高维小样本数据的分析方法，对于大批量数据需要进行分类和主成分分析，学生可以在R软件或Matlab软件中完成处理工作。结合分类结果，还可以对光谱图的进行图谱分析，查找特征峰。

3 实践效果

上述实验是在本科生第二课堂及科研训练中完成，因此并不完全拘泥于形式，实验过程以检测系统的操作手册为主，并结合文献进行数据分析。

3.1 培养了学生的研究兴趣

在认识实验中，实验室提供了3种水晶制品：黄晶、粉晶和灰晶，也有学生带自己的水晶制品。实验中学生观察谱线的特点。由于水晶制品质量的不同以及检测功率的不同，我们指导学生做了定性的分析。有兴趣的学生还带来翡翠等其他宝石类制品进行观察研究，达到了认识实验的目的。

在应用实验中，学生也集思广益，提出检测多种样品，比如牛奶、饮料等。但考虑到目前市售牛奶多为合格产品，可能不含有三聚氰胺或含量较低，因此在完成指定实验内容后，指导学生做了相应的检测实验并结合文献［5－9］分析了处理后的数据。

3.2 提高了学生的科研能力

在整个实验设计中，我们突出了研究方法的学习，使学生不仅掌握了一种实验仪器，也学习了科学研究的方法和过程。从学生进入实验室开始，就指导学生进行文献查询；在实验过程中也充分尊重学生的实验思路，以启发和鼓励为主，尽可能地帮助学生设计一个科学合理的实验过程；后期的数据处理和分析也是一个完整的科研训练不可缺少的部分，图3为学生检测和处理后的数据图。

图3 学生食用油实验数据与去基线处理结果

3.3 构建教学科研互动平台

在上述实验后，临床专业的学生掌握了一种新的检测方法，在他们未来的工作，尤其是科研工作中将发挥一定的作用，也有利于拉曼光谱检测技术在临床中的推广和应用。在此基础上，对于生物医学工程专业的学生，我们结合本科生毕业设计的要求，与实验室日常的科研工作相衔接，建立了教学科研互动平台，在掌握实验方法和研究方法后，进一步指导学生对数据进行分析和处理，将科研内容不断地充实到创新性实验教学中，使科研和教学紧密结合，不断获得更新和提高。2008年至今，已有3位学生获得优秀本科生毕业论文，相关的研究成果也发表了科研论文。

4 结论

我们结合实验室已有的科研设备和研究成果，选取一些实验过程易于控制、实验结果易于分析的实验内容引入到本科生的第二课堂和科研训练过程中，探索了利用科研仪器设备进行本科生实验的方法，达到了培养学生研究兴趣、激发学生钻研创新意识、提高学生科学素质的目的，在实践中也取得了良好的效果。

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