氯沙坦对5/6肾切除慢性心衰大鼠的影响

夏雪，崔寒玥，陈丁丁

中国药科大学临床药学教研室，南京 210009

氯沙坦对5/6肾切除慢性心衰大鼠的影响

夏雪，崔寒玥，陈丁丁*

中国药科大学临床药学教研室，南京 210009

目的：主要探讨氯沙坦对5/6肾切除慢性心衰模型大鼠心血管的影响。方法：雄性SD大鼠30只随机分为假手术组（Sham）、病理组（Nx）和氯沙坦治疗组（Lst）。Nx组和Lst组行5/6肾切除术，Lst组于术后第7周初于饮水中连续两周给予氯沙坦（10 mg·kg-1·d-1）治疗。8周末处理所有大鼠，测定血流动力学参数、心指数、血管舒张度、血清肌酐、尿素氮以及心肌和血管组织中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：与Nx组比较，Lst组大鼠LVEDP降低，LVSP、LVDP绝对值升高，心指数降低，血管舒张度增大，血清中肌酐、尿素氮降低，各组织中MDA含量降低，SOD活性升高，结果有显著性差异或极显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。结论：氯沙坦能够改善慢性心衰大鼠左心肥厚、左心和血管内皮功能；降低心肌和血管组织中MDA含量并提高SOD活性，减轻组织氧化应激，对心血管产生有益作用。

氯沙坦；慢性心衰；心血管；氧化应激

心肾综合证（Cardiorenal Syndrome，CRS）是指心脏和肾脏其中一个器官的生理病理紊乱引起的急性或慢性功能障碍可诱发另一器官的急性或慢性功能障碍，Ronco等[1]将其分为5个亚型，其中尿毒症引起的心脏病变属于Ⅳ型CRS。一氧化氮-活性氧簇（NO-ROS）失衡、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和交感神经系统激活以及炎症都会加重心衰与肾衰[2]。氯沙坦（losartan，LST）作为一种选择性血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）受体（AT1受体，Angiotensin type 1 receptor）拮抗药，可作用于肾素-血管紧张素系统（RAS）。本文通过5/6肾切除术制备慢性心衰大鼠病理模型[3]来研究氯沙坦对尿毒症慢性心衰大鼠心血管的影响。

1 材料

1.1 仪器

722光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；752型紫外分光光度计（上海菁华）；Medlab-U/ 4C501H生物信息采集系统（南京美易科技有限公司）；压力传感器（40 Kpa，北京新航）；BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；JZ100型张力换能器（北京新航）；电子天平（BS124S，北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 药物和试剂

云南白药（云南白药集团股份有限公司，ZK12022）；吸收性明胶海绵（金陵药业，110819）；戊巴比妥钠（德国分装，WS20080118）；氯沙坦钾片（默沙东，120802）；肌酐（Cr）试剂盒（南京建成，20131224）；尿素氮（BUN）试剂盒（南京建成，20131225）；考马斯亮蓝G-250（上海化学试剂有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，Biosharp，Lot.738328）；十二烷基硫酸钠（SDS，上海卫辉化学试剂厂）；硫代巴比妥酸（TBA，国药集团化学试剂有限公司，Lot. YF20060925）；TEP（1，1，3，3-Tetraethoxypropane，Fluka，G00877）；焦性没食子酸（贵州遵义市第三化工厂，批号991203）；苯肾上腺素（Phenylephrine hydrochloride/PE，Sigma，116K1492）；乙酰胆碱（Acetylcholine/Ach，Sigma，116K0689）；硝普钠（Sodiumnitroprusside/SNP，上海山浦公司，批号20051110）。

1.3 动物

清洁级（SPF）雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，体重（160±20）g，由南京市江宁区青龙山实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（浙）-2008-0033；饲料为定制的高磷高钙（Ca：1.13%；P：0.94%，以保证动物营养及造模成功率），亦由其提供。

2 方法

2.1 分组

采用随机分组，将30只雄性SD大鼠分为假手术（Sham）组（n=10）、病理（Nx）组（n=10）和治疗（Lst）组（n=10）。

2.2 造模方法及治疗方案

Nx组和Lst组大鼠用戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉后，按两次手术切除法行5/6肾切除术，第一次切除大鼠左肾皮质的2/3，约0.45 g，一周后再摘除整个右肾；Sham组仅剥离肾包膜而不切除肾组织。术后，Sham和Nx组均给予正常饮食和水；Lst组前6周给予正常饮食和水，第7周起连续两周根据整笼大鼠体重和饮水量将氯沙坦用纯水配制成适当浓度，给予10 mg·kg-1·d-1的治疗。

2.3 血流动力学测定

8周末，行大鼠颈总动脉左心室插管术，记录各组大鼠的左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张压（LVDP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室内压最大上升速率（dp/dtmax）和左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax），评价心功能。

2.4 心指数的测定

8周末，取各组大鼠心脏，生理盐水洗净并去除多余脂肪组织，吸干表面水分，迅速剪取左心室，称左心室及全心重量，计算左心室重量指数：左心室重量/全心重（LVW/HW，g·g-1），左心室重量/体重（LVW/BW，g·kg-1）和全心重/体重（HW/BW，g·kg-1）。

2.5 血清肌酐和尿素氮的测定

8周末对各组大鼠进行颈总动脉取血，3500 r· min-1离心10 min后取上清液，按肌酐和尿素氮试剂盒说明书测定肌酐、尿素氮含量。

2.6 血管舒张度的测定

8周末，分离各组大鼠胸主动脉，去除血管外周脂肪与结缔组织，剪制长约4 mm的血管环，悬挂于内盛Krebs溶液（自制，pH 7.4）并通以95%和5% CO2混合气的37℃恒温水浴槽中。给予0.5 g静息张力，平衡1 h左右至稳定后，用苯肾上腺素（PE）预激达稳定并记录收缩值，按累计浓度（10-9～10-4mol· L-1）给予乙酰胆碱、硝普钠，每次给药2 min后记录舒张值；洗脱1 h，方法同上，用PE预激，按累计浓度（10-9～10-4mol·L-1）给予硝普钠，每次给药1 min后记录血管舒张值。全部舒血管作用以其舒张幅度占PE收缩幅度的百分比表示。

2.7 组织中MDA和SOD活性含量的测定

称取一定量各组织用生理盐水进行10%的组织匀浆，4000 r·min-1离心10 min，取匀浆上清液用于总蛋白、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定。总蛋白用Bradford法（考马斯亮蓝G-250染料法）测定，MDA采用硫代巴比妥酸法测定，结果用MDA/总蛋白（nmol·mg-1）表示。SOD采用邻苯三酚自氧化法测定，结果用SOD/总蛋白（U·mg-1）表示。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 血流动力学

Nx组大鼠与Sham组相比LVEDP升高，差异有极显著性（P＜0.01）；LVSP、LVDP、dp/dtmax、-dp/ dtmax绝对值降低，差异有显著性或极显著性（P＜0.05或P＜0.01）。Lst组较Nx组LVEDP降低，差异有显著性（P＜0.05），与Sham组无差异；较Nx组LVSP、LVDP绝对值明显升高，差异有极显著性（P＜0.01），与Sham组无差异；dp/dtmax、-dp/dtmax绝对值较Nx组明显升高，但差异无显著性，与Sham组无差异。结果见表1。

表1 各组大鼠血流动力学参数（±s，n=7）

表1 各组大鼠血流动力学参数（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLVSP（mmHg）LVDP（mmHg）LVEDP（mmHg）dp/dtmax（mmHg·s-1）-dp/dtmax（mmHg·s-1）Sham152.71±16.35-27.17±3.77-14.62±3.459289.56±1648.83-7465.22±1150.68Nx121.32±16.64**-17.86±2.62**-8.05±4.75**6878.3±1538.78*-5345.06±1550.09*Lst147.67±15.81△△-23.25±4.74△△-13.41±2.41△8264.81±1488.46-6598.67±620.56

3.2 心指数

Nx组大鼠左心室的重量指数LVW/HW、LVW/ BW以及HW/BW均较Sham组大鼠显著升高（P＜0.01）。Lst组的LVW/HW、LVW/BW以及HW/BW均较Nx组降低（P＜0.05或P＜0.01），与Sham组相比无显著差异。结果见表2。

表2 各组大鼠心指数参数（±s，n=7）

表2 各组大鼠心指数参数（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLVW/HW（g·g-1）LVW/BW（g·kg-1）HW/BW（g·kg-1）Sham0.41±0.031.01±0.092.49±0.12Nx0.48±0.02**1.52±0.23**3.14±0.46**Lst0.43±0.02△1.11±0.03△△2.56±0.11△△

3.3 血清肌酐、尿素氮含量

Nx组的血清肌酐和尿素氮均较Sham组水平明显升高（P＜0.01）。另外相比于Nx组，Lst组的肌酐差异有极显著性（P＜0.01），尿素氮差异具有显著性（P＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠血清肌酐和尿素氮含量（±s，n=7）

表3 各组大鼠血清肌酐和尿素氮含量（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

Groups肌酐（mg·dl-1）尿素氮（mg·dl-1）Sham1.85±0.3916.75±2.72Nx2.82±0.2**34.74±6.49**Lst2.36±0.36*△△27.10±4.43**△

3.4 血管舒张度

用乙酰胆碱（Ach）舒张血管时，Sham组最大舒张度为76.83%，而Nx组仅有49.43%，Nx组较Sham组血管的舒张功能明显降低，且差异具有极显著性（P＜0.01）；Lst组最大可达68%，较Nx组有明显改善，差异具有极显著性（P＜0.01）。各组经硝普钠（SNP）舒张后的最大舒张度无显著差异。结果见表4。

表4 各组大鼠经Ach和SNP刺激后的血管舒张度（±s，n=7）

表4 各组大鼠经Ach和SNP刺激后的血管舒张度（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsLg[Ach]Lg[SNP]Sham-76.83±11.47-100.2±1.84Nx-49.43±20.37**-99.47±2.18Lst-68.44±13.47△-99.58±2.58

3.5 组织中MDA含量和SOD活性

Nx组心肌和血管组织中MDA的含量均较Sham组升高，差异分别具有极显著性（P＜0.01）和显著性（P＜0.05）。Lst组心肌组织中MDA含量较Nx组低，差异具有极显著性（P＜0.01），血管组织中的MDA差异具有显著性（P＜0.05）。此外，Nx组心肌和血管组织中SOD酶活性均较Sham组降低，差异具有极显著性（P＜0.01）。Lst组心肌和血管组织中的SOD酶活性则较Nx组高，且差异具有极显著性（P＜0.01），但与Sham组无显著性差异。结果见表5。

表5 各组大鼠组织中MDA含量及SOD活性（±s，n=7）

表5 各组大鼠组织中MDA含量及SOD活性（±s，n=7）

注：*P＜0.05 vs Sham；**P＜0.01 vs Sham；△P＜0.05 vs NX；△△P＜0.01 vs NX

GroupsMDA（nmol·mg-1）SOD（U·mg-1）心肌组织主动脉心肌组织主动脉Sham0.72±0.231.45±0.4539.75±11.5530.10±11.55Nx1.22±0.24**2.06±0.46*21.44±9.36**13.38±9.21**Lst0.90±0.18△△1.58±0.35△35.55±8.32△△27.66±8.32△△

4 讨论

有文献报道5/6肾切除后8周大鼠有明显的左室心衰现象，其生理病理学特点是左室收缩、舒张功能（主要是舒张）的衰竭和左室心肌肥厚重构[4]。从心指数结果中可以看出，Nx组大鼠较Sham组大鼠发生了明显的心肌重构，导致了心室肥厚，表明大鼠已有器质性病变，而血流动力学的变化提示大鼠出现心衰，相对于慢性心力衰竭患者的C期，即有器质性心脏病并有心衰症状[5]。由左心室重量指数LVW/HW、LVW/BW以及HW/BW结果可发现，在使用氯沙坦治疗后，大鼠的心肌肥厚指数较Nx组明显降低，表明氯沙坦对该模型大鼠的左心室肥厚具有一定的逆转作用，这与已报道的氯沙坦能减轻高血压患者左心肥厚[6]和逆转大鼠压力负荷型心肌肥厚[7]的结果一致。此外，Lst组血清肌酐和尿素氮较Nx组明显降低，表明大鼠的肾衰程度因氯沙坦的干预有一定改善，与氯沙坦可增强糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力、减轻氧化应激、减少蛋白尿和肾脏损害[8]的结果一致。血流动力学结果显示，Nx组较Sham组LVEDP升高（P＜0.01），LVSP、dp/dtm、-dp/ dtm绝对值降低（P＜0.05或P＜0.01），提示Nx组大鼠心脏可能因缺血损伤与心肌肥厚导致了心脏收缩与舒张功能的减退，使得LVSP下降，LVEDP升高，容量负荷加重。Lst组较Nx组LVEDP显著降低（P＜0.05），dp/dtmax、-dp/dtmax绝对值升高显著（P＜0.05），提示经氯沙坦治疗后，大鼠的心肌收缩与舒张能力增强，左室容量负荷减轻，表明氯沙坦确有较好的心脏保护作用。

由血管舒张度测定结果可知，SNP处理时，各组大鼠胸主动脉的血管舒张度无明显差异，但用Ach处理时Nx组较Sham组的血管舒张功能明显降低，差异具有极显著性（P＜0.01），表明5/6肾切除造成了胸主动脉内皮依赖性舒张功能的损伤，提示血管内皮受损。血管内皮的损伤因素包括氧自由基、血管紧张素Ⅱ和炎症等。在结果中，Lst组心肌和血管组织中MDA含量较Nx组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD活性明显升高（P＜0.01），提示氯沙坦可使本模型中大鼠心血管组织中SOD活性增强，MDA减少，减轻组织的氧化损伤。目前已有文献表明可降低高糖状态下人脐静脉内皮细胞中的MDA含量，提高SOD活性[9]；能够抑制氧化应激，减少活性氧簇生成[10]。RAS在心血管疾病中起着重要作用，该系统中的血管紧张素Ⅱ可通过NADPH氧化酶产生氧自由基[11]，氯沙坦作为AT1受体阻断剂则可阻断血管紧张素Ⅱ的这一作用。此外，还有文献报道氯沙坦能够提高高盐高血压大鼠血浆一氧化氮（NO）水平，减少由NADPH介导的过氧化物生成，提高内皮功能[12]等；提示氯沙坦可能通过减轻血管内皮细胞的氧化应激来保护血管内皮。以上都为氯沙坦能够减轻机体组织的氧化应激，可能是通过AT1受体调节抑制NAD（P）H的活性，保护线粒体功能提供了依据。另有文献报道，氯沙坦对离体大鼠胸主动脉的舒张作用具有内皮依赖性[13]。本试验中Lst组血管舒张功能较Nx组明显改善，差异具有极显著性（P＜0.01），与Sham组无差异，表明Lst组主动脉内皮损伤较Nx组轻，其他研究结果也提示氯沙坦能够减少炎症因子的释放，从而保护心血管系统，并且对损伤的血管内皮可能具有一定的修复作用，具体机制有待进一步探索。

综上所述，氯沙坦通过AT1受体阻断作用逆转5/6肾切除慢性心衰大鼠模型的心肌肥厚并改善左心和血管内皮功能，增强心血管组织的抗氧化能力，减轻氧化应激的作用确切，这些作用对尿毒症并发心血管疾病的防治具有极其重要的意义。本试验为氯沙坦临床应用提供了一定的理论依据。

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Effects of Losartan on 5/6 Nephrectomy Rats with CHF

XIA Xue,CUI Han-yue,CHEN Ding-ding*
Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objevtives:To explore the cardiovascular effects of losartan in 5/6 nephrectomy rats with chronic heart failure(CHF).Methods：Thirty male SD(Sprague Dawley)rats were randomly divided into sham group(sham),pathology group(Nx)and losartan group(Lst).Nx group and Lst group were induced by 5/ 6 nephrectomy.Rats in the Lst group were given losatan(10 mg·kg-1·d-1)through drinking water from the beginning of the postoperative 7th week to the end of the 8th week.At the end of the 8th week,all rats were measured for hemodynamic parameters,cardiac index,vasodilation degrees,serum creatinine and urea nitrogen,and the malondialdehyde(MDA)contents and superoxide dismutase(SOD)activities in myocardium and aorta tissues.Results：Compared with the Nx group,rats in the Lst group had decreased LVEDP, cardiac index,serum urea nitrogen and creatinine,and tissue MDA content;and increased LVSP,LVDP, vasodilation and tissue SOD activity.The differences were significant or very significant(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion：Losartan can improve left ventricular hypertrophy and the left ventricular and vascular endothelial functions of rats with CHF.It also may have beneficial effects to the myocardium and aorta tissues by reducing tissue oxidative stress of CHF rats.

Losartan;CHF;Cardiovascular;Oxidative stress

R965

A

1673-7806（2014）03-222-04

夏雪，女，硕士生 E-mail:jyjpxx@163.com

*通讯作者 陈丁丁，男，副教授 E-mail:chdd@cpu.edu.cn

2014-03-09

2014-04-08