射干不同采收期黄酮类成分的动态变化规律*

普冰清，朱艳**，许方云，李鋆，秦民坚**

中国药科大学 1中药资源学教研室；2天然药物活性成分与药效国家重点实验室，南京 210009

射干不同采收期黄酮类成分的动态变化规律*

普冰清1，2，朱艳1，2**，许方云1，李鋆1，秦民坚1，2**

中国药科大学1中药资源学教研室；2天然药物活性成分与药效国家重点实验室，南京 210009

为确定射干最佳采收年限和最佳采收时间，应用HPLC法测定二年生和三年生栽培射干春、秋季不同采收时间中12种黄酮类成分含量的动态变化。结果显示：以黄酮类活性成分作为指标，在南京栽培的射干以二年生采收较优，时间以春季5月上、中旬采收时间最佳。

射干；高效液相色谱；黄酮类含量；最佳采收年限；采收期

射干Belamcanda chinensis（L.）DC.为鸢尾科射干属植物，以根茎入药。我国射干属仅1种，分布于全国各省，主产湖北、河南、江苏和安徽等地。射干首载于《神农本草经》，历版《中国药典》都有收载；该药材能清热解毒、消痰、利咽[1]。有研究表明，射干的有效成分主要是黄酮类化合物，鸢尾苷及其苷元具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病原微生物等作用[2]。据本课题组前期研究，栽培于南京的射干黄酮类成分含量春季和秋季都有一个高峰期[3-4]；但由于当时所测的成分数量有限及方法的局限性，不能完全反映该中药材的质量变化。因此，在前期研究工作的基础上，本研究把射干春、秋适宜采收期中的取样时间点细化为每月三次，采用HPLC法同时对在南京栽培的二年和三年生射干春、秋季不同采收期的12种黄酮类成分进行含量测定，研究其动态变化规律，以确定射干的最佳采收期，并为射干的质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100系列高效液相色谱仪，UV检测器，Agilent色谱工作站；Sartorius CPA224S分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；QE-100药材粉碎机（武义县屹立工具有限公司）；LGJ-18S冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.2 药材与试剂

二年生及三年生射干根茎采自中国药科大学药用植物园，经本文作者之一秦民坚教授鉴定为鸢尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.。

新芒果苷（neomangiferin，1）、芒果苷（mangiferin，2）、鸢尾苷（tectoridin，3）、鸢尾新苷B（iristectorin B，4）、鸢尾新苷A（iristectorin A，5）、野鸢尾苷（iridin，6）、鸢尾黄素（tectorigenin，7）、鸢尾甲黄素A（iristectorigenin A，8）、野鸢尾黄素（irigenin，9）、次野鸢尾黄素（irisflorentin，10）、德鸢尾素（irilone，11）和白射干素（dichtomitin，12）对照品，均为本实验室自制，经1H-NMR、13C-NMR鉴定和HPLC法检测，纯度均＞98%；色谱级乙腈（Merk，Germany）。

2 方法

2.1 采收时间

分别于2012年春季4、5月和秋季9、10、11月，每月的5、15、25日采收实验样品；采用对角线取样法，在试验田中按对角线选定5个取样点，每个取样点上随机挖取1株。采集植物样品后去泥，洗净，剪去须根及地上部分，取其根茎，切片，冷冻干燥，取出置于干燥器中回升至室温，粉碎，过60目筛，过筛粉末作为实验样品。

2.2 对照品溶液制备

精密称取适量新芒果苷（1）、芒果苷（2）、鸢尾苷（3）、鸢尾新苷B（4）、鸢尾新苷A（5）、野鸢尾苷（6）、鸢尾黄素（7）、鸢尾甲黄素A（8）、野鸢尾黄素（9）、次野鸢尾黄素（10）、德鸢尾素（11）、白射干素（12）对照品，用75%甲醇溶解并定容至1 mL，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

精密称取射干样品粉末（过60目筛）0.10 g于离心管中，加入75%甲醇10 mL，超声提取30 min，3000 r·min-1离心5 min，上清液移入25 mL量瓶中，残渣再重复提取一次，合并上清液，冷却至室温后用75%甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 色谱条件

建立了同时测定射干中12种黄酮类成分的方法。色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；预柱：Alltech C18guard column（7.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）及0.4%冰醋酸（A），梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：269 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。对照品及样品的高效液相色谱见图1。

表1 洗脱梯度条件

图1 对照品及样品高效液相色谱图

2.5 标准曲线制备

分别精密吸取混合对照品溶液6个不同体积，置量瓶中，75%甲醇定容至刻度，进样20 μL，测定。以峰面积Y为纵坐标，浓度X（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程见表2。

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，测定其日内精密度；连续6天进样，测定其日间精密度。日内精密度小于2.20%，日间精密度小于3.60%，说明仪器的精密度良好。

表2 射干根茎中黄酮类成分标准曲线

2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（2012年9月5日采集的二年生射干样品），分别于0、3、6、12、24 h测定。RSD均小于4.00%，说明供试品溶液的稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取同一供试品射干根茎粉共6份，按“2.3”项下方法制备溶液，分别进样，记录峰面积，计算12种成分含量，RSD均小于4.10%，说明方法重复性好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品0.05 g制备供试品溶液，加入已知浓度的混合对照品溶液适量，制备3份，分别测定加样回收率。12种对照品的加样回收率为96.75%～101.39%，说明加样回收率良好。

3 结果与讨论

3.1 样品含量测定

分别精密称取样品粉末0.10 g。按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样分析，分别测定样品中各黄酮类成分含量（每份样品3次重复，计算Mean和SD值），见图2和图3。

3.2 不同采收期黄酮类成分含量的动态变化

由图2可知，不同生长年限射干在春、秋季不同采收期，其总黄酮含量变化趋势基本相似。

图2 不同采收期总黄酮含量动态变化图

图3 不同采收期12种黄酮类成分含量动态变化

射干中黄酮苷及苷元的变化趋势基本一致，均表现为春季采收期含量高于秋季采收期，其中春季采收期二年生和三年生射干以5月上旬和中旬含量最高。秋季采收期，二年生射干中黄酮苷含量于9月末达到最高，黄酮苷元含量于10月初达到最高；三年生射干中黄酮苷和苷元含量均于11月初达到最高。

有研究表明，射干中的鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾苷元和芒果苷具有抗炎作用[5]，鸢尾新苷A和鸢尾新苷B也具有清除氧自由基活性[6]。同时，鸢尾苷、鸢尾新苷A、鸢尾新苷B和野鸢尾苷为射干中的主要成分，而次野鸢尾黄素是《中国药典》规定指标成分（≥0.01%）。因此，本文重点对芒果苷、鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾新苷A、鸢尾新苷B、野鸢尾苷、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素在采收期中的含量动态变化进行分析。

由图3和表3可知，二年生射干中，次野鸢尾黄素和白射干素成分，春季含量高，4月5日达最高值，其后含量有所回落，4月25日含量有所回升，5月其含量变化比较平稳，9月初这两种成分从较低的含量逐渐回升，9月下旬至10月中旬其含量变化比较平稳，10月末和11月含量又逐渐降低。芒果苷于4月初开始含量逐渐增加，至4月25日达到含量最高值后开始逐渐降低，至5月底到达含量最低值；9月芒果苷含量变化较平稳，至10月初达到秋季最高值后，含量逐渐下降。鸢尾黄素、野鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A和新芒果苷于4月含量先下降至5月初含量骤然升高，5月15日达到高峰值之后又骤然降低，9月初从含量最低值逐渐回升，于10月上旬达到秋季高峰后又缓慢降低。鸢尾苷、鸢尾新苷B、鸢尾新苷A、野鸢尾苷和德鸢尾素在春季采收期，含量逐渐升高，均于5月5日达到最高值，之后含量下降，它们的含量在秋季采收期变化较稳定。

图3和表3表明，三年生射干中，鸢尾苷、鸢尾黄素、新芒果苷、鸢尾新苷A、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、德鸢尾素和白射干素成分含量春季4月含量变化较平稳，5月含量显著增加，于5月5日达到最高值后含量逐渐下降；芒果苷含量5月时含量较高，其后有所下降，于10月5日达到最大值后缓慢降低；鸢尾新苷B含量较稳定，于5月15日达到最大；野鸢尾苷含量在春季含量较高，变化比较平稳，于5月15日达到最大值后又降低，秋季于11月5日又出现高峰，之后迅速降低。

3.3 不同生长年限射干主要黄酮类成分含量比较

通过比较不同生长年限射干各种黄酮类成分含量最大值（见表3），表明二年生射干中芒果苷、鸢尾苷、鸢尾新苷B、鸢尾新苷A、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A和白射干素含量高于三年生；三年生射干中新芒果苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素和德鸢尾素含量高于二年生。二年生射干中总黄酮苷类成分含量显著高于三年生，而总黄酮苷元三年生的较高。由于黄酮苷类成分为总黄酮中的主要成分，从而二年生射干中总黄酮类成分含量较三年生高。通过以上分析表明，二年生射干中大部分黄酮类成分含量较三年生的高，二年生射干质量相对高于三年生射干。

4 结论

黄酮类成分作为射干根茎中的主要有效成分，其含量高低决定着射干药材的质量，随着射干生长发育阶段的自然条件更迭，其体内黄酮类成分的含量会随之发生动态变化[3-4]。经过冬季的休眠期，4月份射干越冬芽开始展叶和转绿[7]，此时，射干的地上和地下器官的生理活动逐渐加强，黄酮类成分逐渐增加。5月初，随着温度逐渐增高，射干植株生长迅速，与此同时，根茎内黄酮类成分含量达到最大值。射干5月中旬开始抽出地上茎，植株迅速长高，从营养生长向生殖发育过渡，根茎内的黄酮类成分含量从最高点逐渐下降。6～8月为射干花期，9月果实开始成熟，果期持续一个月左右，9月末至10月初，射干种子成熟并开始散落，10月地上部分逐渐枯萎，10月下旬地上部分开始倒伏，此时，射干根茎中黄酮类成分含量较高且稳定。11月中旬射干地上部分均枯萎，此时，二年生射干根茎内黄酮类成分含量均最低。射干黄酮类成分含量春季和秋季都有一个高峰期，这与传统上根及根茎类药材适宜在春秋两季采挖的理论相吻合[8]。随着生长年限的延长，三年生射干根茎的生理活性有所降低，大部分黄酮类成分含量有所下降，但幅度不大。因此，射干的采收年限应综合射干的生物学性状、有效成分含量和经济效益等因素考虑。建议以采收生长二年者为佳，采收时间以春季5月中上旬抽出地上茎前，秋季以10月果实成熟，种子脱落后采收为宜，其中又以5月中上旬抽出地上茎前采收为最佳选择。

表3 不同生长年限射干中黄酮类成分最高含量比较

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Chronological Variation Patterns of Flavonoid Contents in the Rhizomes of Belamcanda*

PU Bing-qing1,2,ZHU Yan1,2**,XU Fang-yun1,LI Jun1,QIN Min-jian1,2**
1Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines;2State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

To determine the optimum harvesting age and time for rhizomes ofBelamcanda chinensis(L.)DC.,contents of twelve flavonoids in the biennial and triennial rhizomes ofB.chinensis(L.)DC.from different sampling points during the spring and autumn of 2012 were analyzed by an HPLC method.In conclusion,taking the flavonoids contents as index,the optimum harvesting time for rhizomes of B.chinensis cultivated in Nanjing should be in May(before terrestrial stems growing)and the optimum harvesting age should be biennial.

Belamcanda chinensis(L.)DC.;High performance liquid chromatography;Flavonoids contents;Optimum harvesting age;Optimum harvesting time

R284.1

A

1673-7806（2014）03-212-04

国家自然科学基金项目（81373918）；国家“十二五”规划科技重大专项创新药物研究（2012ZX09304006）；中央高校科研业务费（JKQ2011038）

普冰清，女，硕士生 E-mail:kypbq@163.com

**通讯作者 秦民坚，男，博士，教授，研究方向：中药资源与开发 E-mail:minjianqin@163.com；朱艳，女，博士，研究方向：药用植物种质资源与生物技术 E-mail:cpuzy@126.com

2014-02-26

2014-03-07