HPLC法测定复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量

邰顺章，袁步娟，黄柳燕

1盐城市药品检验所，盐城 224002；2盐城师范学院，盐城 224002

HPLC法测定复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量

邰顺章1，袁步娟1，黄柳燕2

1盐城市药品检验所，盐城 224002；2盐城师范学院，盐城 224002

目的：建立同时测定复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸含量的HPLC检测方法。方法：采用Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1；检测波长237 nm；进样量：10 μL；柱温30℃。结果：甘草苷、甘草酸分别在10.65～42.60 mg·L-1、97.30～389.30 mg·L-1范围内呈良好的线性关系，r分别为1.0000、1.0000；平均回收率（n=6）分别为98.80%（RSD=0.73%）、99.84%（RSD=0.10%）。测得6批复方桔梗止咳片，每片分别含甘草苷135.28 μg、123.16 μg、113.21 μg、136.08 μg、160.84 μg、156.32 μg，甘草酸441.36 μg、405.86 μg、364.69 μg、446.93 μg、518.22 μg、509.65 μg。结论：该方法简便，重复性好，可用于同时测定复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸的含量。

复方桔梗止咳片；高效液相色谱法；甘草苷；甘草酸；含量测定

复方桔梗止咳片是镇咳、祛痰的复方中药制剂，由桔梗、远志（蜜炙）、款冬花（蜜炙）、甘草4味中药组成，适用于咳嗽多痰，寒热症状不明显的患者。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的作用，是该制剂的主要成分之一。在该制剂中，以甘草的提取物入药，其主要活性成分为甘草苷和甘草酸。现行质量标准中没有收载该药有效成分含量测定的方法[1]，文献中用薄层色谱法对该药主要成分进行定性鉴别[2]和用HPLC法测定甘草酸含量[3]的报道，《中国药典》[4]及有关文献载有甘草药材和饮片中有效成分的含量测定方法[5-8]，也有文献报道了含甘草的中药制剂的有效成分含量测定的方法[9-10]。本文对该药有效成分的测定方法进行探索，建立了HPLC法同时测定复方桔梗止咳片中甘草苷和甘草酸的含量，该法简便、灵敏、准确、重复性好，为该药质量控制与评价提供了参考方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱系统（岛津LC-20A高效液相色谱仪，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC-20AB真空脱气机，SIL-20A自动进样器，岛津LC-20A色谱工作站）；XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；YCQ-300超声波清洗器（上海凯波超声设备有限公司）。

1.2 试药

甘草苷对照品（批号：111610-200604，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12小时使用），中国药品生物制品检定所）；甘草酸铵对照品（批号：110731-201317，纯度92.6%，干燥同甘草苷，中国食品药品检定研究院）；复方桔梗止咳片（通化中辰药业有限责任公司，规格：每片重0.25 g，批号：20121206、20121208、20121212、20130309；河南羚锐制药股份有限公司，规格：每片重0.25 g，批号：120619、121208）；乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取甘草苷对照品10.65 mg，置50 mL量瓶中，加入70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得甘草苷储备液；精密称取甘草酸铵对照品42.68 mg，置于20 mL量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度，即得甘草酸铵储备液（甘草酸重量=甘草酸铵重量/ 1.0207）。分别精密量取上述两种对照品储备液各2 mL，用70%乙醇定容至20 mL，即得两种对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取本品40片，称定，研细，精密称取约15片重，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按表1中的程序进行梯度洗脱；流速：1.0 mL· min-1；柱温：30℃；紫外检测波长：237 nm；进样量：10 μL。理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000，与相邻组分分离度大于1.5，对照品和供试品色谱图见图1和图2。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 甘草苷、甘草酸铵对照品色谱图

图2 复方桔梗止咳片色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.1”项下两种对照品储备液1、1.6、2、3、4 mL，用70%乙醇分别定容至20 mL，得系列标准对照溶液，进样分析。甘草苷以峰面积与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=21108C-6819，r= 1.0000（n=5），表明甘草苷浓度在10.65～42.60 mg·L-1范围内与峰面积呈良好线性关系；甘草酸以峰面积与浓度进行线性回归，得回归方程为：A=5880.4C-4970，r=1.0000（n=5），表明甘草酸浓度在97.30～389.30 mg·L-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取同一对照品溶液，连续进样6次，甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.13%、0.14%，表明仪器精密度良好。取批号为20121206的样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析：平均每片中甘草苷的含量（μg）分别为134.96、135.00、135.82、135.18、134.76和136.98，平均135.45；平均每片中甘草酸的含量（μg）分别为439.72、439.45、439.44、440.81、441.62和442.63，平均440.61；RSD分别为0.63%、0.81%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性实验

取批号为20121206的供试品溶液，室温下放置，每隔3 h进样一次，测定6次，甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为0.9%、0.71%（n=6），结果表明供试品溶液室温放置15 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密量取对照品储备液2 mL，置于20 mL量瓶中，共6份，用批号为20121206样品的供试品溶液定容至刻度，进样分析，测定回收率，结果见表2。表明复方桔梗止咳片用本法测定回收率良好。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.8 供试品含量测定

取供试品溶液，滤过，进样，测定。用回归方程计算供试品的含量，测定6批样品，每批样品测定2次，结果见表3。

3 讨论

3.1 样品提取溶剂和提取时间的选择

根据有关文献介绍比较了水、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行超声提取实验，结果表明用70%乙醇提取效率最高。比较了不同提取时间（15、20、30、40、60 min）对提取效果的影响，结果表明超声30 min已基本将两种组分提取完全。

表3 供试品含量测定结果（%，n=6）

3.2 样品提取方法的选择

本实验对冷浸、超声提取、回流提取、索氏提取4种方法进行了考察，结果表明超声提取对两种组分的提取效率都较高，同时超声提取时间短、操作简便易行，故样品制备方法采取用70%乙醇超声提取30 min。

3.3 根据相关文献采用的流动相情况，实验中分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙睛-0.5%醋酸和0.05%磷酸溶液-乙腈4种流动相系统的分离效果，结果表明以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，两组分峰形对称且分离度好，避免了该药其它组分的干扰，且不会对色谱柱产生负面影响。本实验在《中国药典》[4]梯度程序基础上优化了梯度比例，大大缩短了洗脱时间，且避免了因流动相比例变化幅度过大产生的溶剂峰。

[1] 卫生部.部颁标准中药成方制剂（第4册）[S].1991：121.

[2] 简淑娟，翁雪萍.复方桔梗止咳片的薄层色谱鉴别[J].广东药学，2001，11（6）：29-30.

[3] 韦向红.HPLC法测定复方桔梗止咳片中甘草酸的含量[J].广西中医学院学报，2006，9（2）：67-9.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：化学工业出版社，2010：80-1.

[5] 何三民，石森林.HPLC法测定甘草中甘草素、异甘草素、甘草苷的含量[J].中草药，2004，34（7）：618-9.

[6] 付玉杰，祖元刚，赵春建，等.RP-HPLC法测定甘草中甘草苷和异甘草苷的含量[J].中草药，2004，35（5）：576-7.

[7] 吕归宝，刘军.HPLC法测定甘草及其制剂中甘草酸的含量[J].药物分析杂志，1998，8（3）：137.

[8] 崔淑芬，张信青，许柏球，等.高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷的含量[J].时珍国医国药，2006，17（3）：307-8.

[9] 赵晓莉，崔小兵，吴皓，等.HPLC双波长法测定复方甘草合剂中甘草苷、甘草素及异甘草素的含量[J].中成药，2002，24（3）：175.

[10] 王征，夏宇欣.HPLC法测定脑乐静中甘草酸铵的含量[J].基层中药杂志，2001，15（2）：11.

HPLC Method for Determination of Liquorice Glycosides and Glycyrrhizic acid Content in the Compound Radix Platycodi Cough Tablets

TAI Shun-zhang1,YUN Bu-juan1,HUANG Liu-yan2
1Yancheng Institute for Drug Control,Yancheng 224002;2Yancheng Normal College,Yancheng 224002

Objective：To establish a quantitative method for the determination of licorice glycosides and glycyrrhizic acid in the compound radix platycodi cough tablets by high-performance liquid chromatography (HPLC)coupled with ultraviolet detection.Methods：An Agilent C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)was adopted.The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile-0.05%phosphoric acid in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was set at 237 nm;The sampling volume was 10 μL;The column temperature was 30℃.Results：The calibration curve showed a good linearity in the range of 10.65～42.60 mg·L-1(r=1.0000)for licorice glycosides and 97.30～389.30 mg·L-1(r=1.0000)for glycyrrhizic acid,respectively.The average recoveries(n=6)of licorice glycosides and glycyrrhizic acid were 98.80%(RSD=0.73%)and 99.84%(RSD=0.10%),respectively.Six batches of compound radix platycodi cough tablets were measured and the content per pill was respectively as follows:liquorice glycosides, 135.28 μg,123.16 μg,113.21 μg,136.08 μg,160.84 μg and 156.32 μg;glycyrrhizic acid,441.36 μg,405.86 μg,364.69 μg,446.93 μg,518.22 μg and 509.65 μg.Conclusions:The developed method is simple and reproducible,which can be used for the quantitative determination of licorice glycosides and glycyrrhizic acid in the compound radix platycodi cough tablets.

Compound radix platycodi cough tablets;Licorice glycosides;Glycyrrhizic acid;Content determination;Assay

R927.2

A

1673-7806（2014）02-115-03

邰顺章，男，副主任药师 E-mail:417677528@qq.com

2013-12-18

2014-02-12