葛根总黄酮的提取精制及含量测定方法研究

2014-05-02陈志民郭莹莹杨昌云

中国药业 2014年3期

陈志民，黄阳，郭莹莹，杨昌云

(中国人民解放军第180医院药学科，福建泉州 362000)

葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata Ohwi或粉葛 Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，具有解肌退热、升阳止泻、透疹生津的功效。现代药理学研究证明，葛根具有改善心脑血管循环、扩张冠脉、改善心脏功能等作用[1－2]。同时，葛根还有提高学习记忆力、抗氧化、抗癌等作用。葛根中主要含有总黄酮这一活性成分，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物。目前，葛根已被制成愈风宁心片、葛根素注射剂等多种制剂上市，这些制剂皆以葛根总黄酮为药效成分。本试验旨在探讨不同浓度乙醇对总黄酮提取条件的影响，并用溶剂法对其纯化。研究表明乙醇回流提取黄酮得率较高[3－5]，本试验对其进行优选研究，现报道如下。

1 仪器与试药

UV－8543型可见紫外分光光度计（美国惠普公司）；1100型高效液相色谱仪（Agilent公司），DAD紫外检测器，Zorbax S8－C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为0752－9806）；甲醇和乙腈为色谱醇；乙醇为市售分析纯；葛根药材（广州致信中药饮片有限公司，粤Y20090085）。

2 方法与结果

2.1 葛根总黄酮含量测定

2.1.1 色谱条件

流动相：甲醇－水－乙腈（12∶80 ∶8）；检测波长：250 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃。

2.1.2 溶液制备

精密称取葛根素对照品2mg，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，避光、室温下保存，即得对照品溶液。按照2010年版《中国药典（一部）》[6]葛根供试品溶液的制备方法，取一定量葛根药材粉末（过3号筛），分别依法制备供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

标准曲线绘制：称取葛根素对照品约2mg，精密称定，用甲醇溶解并定容于 100 mL 容量瓶中，精密称取 0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，甲醇定容。以甲醇为空白，在250 nm波长处测定吸光度。结果见表1。以吸光度 A值对浓度(C，μg/mL)进行线性回归，得回归方程 A ＝0.076 8 C ＋0.001 6，R2＝ 0.999 8(n ＝ 6)。

表1 不同质量浓度葛根素在250 nm波长处的吸光度

精密度试验：取葛根素对照品溶液连续进样6次，分别测定峰面积。结果的 RSD为0.84%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：依法制备10 μg/mL对照品溶液6份，进样测定。峰面积结果的 RSD为1.1%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8 h 时进样分析，根据葛根素的峰面积计算。结果的 RSD为1.0%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

加样回收试验：精密量取8 μg/mL供试品溶液9份，各500 μL，置5 mL容量瓶中，分别加质量浓度为10 μg/mL的对照品溶液300，500，1 000 μL，每个质量浓度平行 3份，加流动相稀释至刻度，摇匀，取10 μL进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝9）

2.2 不同批次葛根药材的含量测定

取4个批次的葛根药材粉末（过3号筛），依法分别制备供试品溶液，照2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥD中高效液相色谱法，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL进样测定。色谱图见图1，测定结果见表3。表明各批次药材葛根素含量均高于《中国药典》规定，符合要求，故选取接近平均含量的第4批药材作为下一步试验用药。

图1 高效液相色谱图

2.3 葛根总黄酮提取工艺研究

根据文献资料葛根黄酮提取方法[7]，确定葛根提取方法如下。分别取葛根药材100 g，分别加入10倍量95%乙醇和70%乙醇1 000 mL，加热回流3 h，滤过，残渣加入8倍量乙醇，继续回流3 h，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得到浸膏，真空干燥箱干燥，得葛根提取物。分别精密称取醇提物0.1 g置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解并定容，精密量取1.0 mL置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，摇匀，照分光光度法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅤB]，在250 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算含量，结果见表4。结果表明，采取95%乙醇回流提取 2次，每次3 h，乙醇用量第 1次 10倍量，第2次 8倍量，提取效果较好。

表3 不同批次葛根药材葛根素含量测定结果

表4 不同浓度乙醇提取葛根结果

2.4 葛根总黄酮纯化工艺研究

2.4.1 葛根总黄酮纯化方法考察

回流法：精密称取醇提物粉末0.5 g，置锥形瓶中，加入球形微晶纤维素2.0 g分散粉末，加入乙酸乙酯20 mL，称定质重。水浴回流1 h，放冷，补足乙酸乙酯减失量。抽滤，滤液蒸干。测定蒸发皿前后质量，得固形物质量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 mL置25 mL容量瓶中，定容，再精密量取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后摇匀，照分光光度法[2010年版《中国药典（一部)》附录Ⅴ B]，在 250 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算含量，结果见表5。

表5 两种纯化方法的比较

萃取法：精密称取醇提物粉末0.5 g，置25 mL容量瓶中，加入乙醇20 mL。微热，溶解，转移至125 mL分液漏斗中，加入乙酸乙酯20 mL，萃取，分取乙酸乙酯层，萃取3次，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干。测定蒸发皿前后质量，得固形物质量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 g置25 mL容量瓶中，定容，再精密称取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后摇匀，照分光光度法[2010年版《中国药典（一部)附录ⅤB]，在250 nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算含量，结果见表5。可见，溶剂萃取法纯化葛根总黄酮效果较好。

2.4.2 萃取纯化法优化

试验证明，醇提物溶于不同浓度的乙醇对萃取效率有较大影响。故本试验设计了3种浓度的乙醇溶解葛根醇提物后再萃取，试验方法同萃取法，结果见表6。可见，用30%乙醇溶解样品后再用乙酸乙酯萃取总黄酮可达到较好的纯化效果。