白及多糖的提取与分析

台琪瑞,殷秀惠

（云南省玉溪市人民医院,云南 玉溪 653100）

白及 Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.是一种草本植物,已有上千年的药用历史,其富含的白及胶具有清热利湿、收敛、止血、消肿生肌之功效。现代药理学研究表明,白及胶具有抗感染、抗肿瘤血管生成和加速凝血的作用,而且用其制成的润滑剂、保湿剂、增稠剂等已在食品工业、石油工业、化妆品行业广泛应用[1]。白及胶的主要成分为多糖,但目前对白及多糖的药物结构分析研究还较少。为了探讨白及多糖的分离纯化、结构,研究其分子量的理化性质,本文运用光谱分析法和化学方法对其进行分析研究,现报道如下。

1 仪器与试药

2400 CHN型元素分析仪（美国 PE公司）；UV-2550型紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）；FTIR-650型红外光谱分析仪（苏州华美辰仪器设备有限公司）。DEAE2纤维素（DE252,Whatman公司,批号为 SMGT09）；SphadexG2100和 T2系列标准多糖（Pharmacia公司,批号为 CDF78GD）；考马斯亮蓝 G2250（Sigma公司,批号为WD67D2N）；蒽酮（分析纯,上海琳帝化工有限公司,批号为20120801）；咔唑（分析纯,寿光鲁科化工有限公司,批号为20110709）；氯化钠（分析纯,西陇化工股份有限公司,批号为201203401）。白及选云南白药集团股份有限公司中药饮片分公司饮片（批号为YP20120802）,经鉴定为兰科白及属植物白及的干燥块茎,符合2010年版《中国药典（一部）》的相关规定[2]。

2 方法与结果

2.1 提取

将白及块茎干制品粉碎、烘干,加20倍体积的蒸馏水,在60℃条件下回流提取4 h,重复提取,离心10 min,取上清液,在70℃条件下进行减压浓缩,用3倍体积95%的乙醇进行沉淀,收集沉淀后冷冻、干燥,用Sevag法除去蛋白部分,得到白及多糖粗制品BR1。

2.2 分离纯化

将BR1加入最小体积的水进行溶解,Sevag法除去蛋白部分,采用考马斯亮蓝G-2250法[3]进行无蛋白质检测,流水透析3 d后在真空条件下冷冻干燥,得到BR2。将400mg的BR2在20mL的蒸馏水中溶解,离心5 min,取上清部分,然后在4.0 cm×25.0 cm的阴离子交换纤维素DE-252柱上进行层析,用蒸馏水和氯化钠溶液进行洗脱,流速为24mL/h,通过蒽酮-硫酸法检测,得到洗脱组分,收集后冷冻干燥,得到BR3。将 50 mg的BR3在2 mL的蒸馏水中溶解,离心5 min,取上清部分,然后用1.8 cm×80.0 cm的 Sephadex G-100柱用氯化钠溶液洗脱,流速为 16 mL/h,通过蒽酮-硫酸法检测,收集多糖洗脱峰,进行透析干燥冷冻后,得到BR4。

2.3 纯度鉴定

紫外光谱分析,将BR4配置成溶液,在190～400 nm波长范围进行紫外扫描。元素分析,采用PE2400 CHN型元素分析仪,对BR4中的N,H,C元素含量进行分析。采用Sephadex G-100凝胶柱层析法,柱规格为2.8 cm×60 cm,以蒽酮-硫酸法检测。BR4的紫外吸收光谱见图1,未见260 nm和280 nm波长处的蛋白质和核酸吸收峰。元素分析结果显示,未见N元素,H元素含量为7.0%,C元素含量为41.4%。凝胶柱层析和 GPC分析得到单一对称峰,说明BR4为单一组分。

图1BR4的紫外吸收谱

2.4 相对分子质量测定

通过 GCP法测定BR4的相对分子质量,采用 7.8 mm×300.0mm的Shodex Ohpak SB-802HO不锈钢色谱柱,将T2系列标准多糖用pH=6.8的磷酸盐缓冲液流动相配置成质量浓度为3 g/L的溶液,记录示差色谱图,通过分析软件制成logMw和保留时间的标准曲线。称取样品BR4,对照标准曲线图计算相对分子质量。结果BR4相对分子质量为99658。

2.5 理化性质分析

采用硫酸咔唑法测定己糖醛酸,采用明胶比浊法测定硫酸基[4]。结果显示,BR4为白色系纤维状物质,易溶于水,不溶于有机溶剂；不含己糖醛酸和硫酸基,为中性。

2.6 单糖组分分析

取10 mg BR4加入硫酸溶液5 mL中,100℃条件下水解,用碳酸钡中和,滤液浓缩后在20 cm×20 cm的微晶纤维素板点样,进行单向层析和双向层析,用苯胺-邻苯二甲酸在100℃条件下喷雾显色,用薄层扫描仪扫描,计算扫描峰面积。结果单向薄层层析显示,BR4含有葡萄糖和甘露糖2种单糖,相对含量为3∶4.8。

2.7 红外光谱分析

取BR42 mg,用KBr混合压片,进行行红外扫描。结果BR4红外吸收光谱见图2,其结构中存在吡喃型糖基和甘露糖基,其苷键构型主要为β型。

图2BR4红外吸收光谱

3 讨论

白及多糖目前在众多领域有着广泛的应用,且在医学研究和临床应用中有着良好的发展前景[5]。本研究中通过对白及多糖进行提取,在Sephadex G-100柱上用氯化钠溶液洗脱分离纯化,进行紫外光谱分析,对BR4进行纯度鉴定、相对分子质量测定,并对其理化性质、单糖组分和红外光谱进行了分析,结果显示,白及多糖BR4是一种白色系纤维状物质,溶于水,为中性,含有H元素和C元素,为单一组分,含有葡萄糖和甘露糖2种单糖,存在吡喃型糖基和甘露糖基。目前已知白及多糖的药理作用主要有以下几个方面。

止血:白及多糖是一种杂多糖。白及能增强血小板第Ⅲ因子的活性,缩短凝血酶生成时间,抑制纤维蛋白酶的活性,也能使细胞凝聚,形成人工血栓而止血[6-7]。

黏膜保护:白及多糖有胃黏膜保护作用,能明显减轻由盐酸引起的大鼠胃黏膜损伤,可能与刺激胃黏膜合成和释放内源性前列腺素有关[8]。白及多糖对动物试验性胃溃疡有明显的抑制作用,可促进溃疡动物的溃疡愈合,其抗胃溃疡的机制可能是通过抑制脂质过氧化反应,促进胃黏膜修复[9-11]。白及多糖具有促进溃疡性结肠炎模型小鼠黏膜修复、抑制肌体炎症和恢复免疫平衡的作用,作用机制可能与抑制肿瘤坏死因子 ɑ（TNF-ɑ）和NF-κB、上调白细胞介素（IL-10）水平有关[12]。白及多糖还可通过促进炎症细胞浸润、增加成纤维细胞（OHP）含量的合成和释放、羟脯氨酸（FB）的增殖,促进糖尿病溃疡的创面愈合[13]。

抗菌:白及具有杀菌、消炎作用,毒副作用相对较小。白及乙醇浸液用平板稀释法,1∶100时对金黄色葡萄球菌、1∶20时对枯草杆菌及人型结核杆菌有抑制作用[14]。其产生较强抗菌作用的是白及中的甘露聚糖。

抗肿瘤:白及多糖是一种广谱抗肿瘤成分,其提取物被用作血管栓塞剂,对原发性肝癌具有显著的抑制作用。白及是一种末梢型栓塞剂,能栓塞200～400μm以下的血管,最远可达20～50μm的血管,能大面积地阻断肿瘤的血供,制止肿瘤的再血管化,栓塞时间长久、可靠。白及具有阻断肝癌供血动脉及其侧枝循环的功效,能有效抑制肝癌的生长和复发[15]。

其他:白及属植物中的白及与川乌配伍,为中医配伍禁忌“十八反”之一。化学研究显示,白及与生川乌配伍后,药液中双酯型生物碱的含量增加,毒性增加,这种差异是由于煎煮液的pH不同导致的,药液中双酯型生物碱含量随药液pH的升高而降低[16]。白及中含有的成分可能引起药液pH降低,而使双酯型生物碱的含量增加,使得白及和川乌配伍后毒性增加。

白及属植物虽种类较少,但化学成分复杂、药理活性多样。随着对其化学成分研究的不断深入,药理活性研究也可从总提起物转向各类或各种化学成分的研究,从而发现了一些新的活性及活性成分。因此,有必要对该属植物进一步进行化学成分、药理活性及药理作用机制的研究,以期能更合理、更有效地开发和利用白及属药用植物资源。

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