量子点标记技术在食源性病原体检测中的研究进展

金莹 房保海 姜英辉等

摘要近年来，量子点标记技术得到较快发展，以其为基础开发的检测技术在食品安全检测方面已有广泛应用。为了解量子点标记技术在食源性病原体检测中的应用研究现状，为量子点标记技术在食品安全检测中进一步深入推广，简要综述了量子点的生物相容性及其在食源性病原体检测方面的研究进展和应用前景。

关键词量子点标记；食源性病原体；检测

中图分类号R184.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00245-03

基金项目国家质检总局项目“基于量子点标记技术的食源性致病菌快速检测技术研究”（2011IK221）。

作者简介金莹（1981- ），女，山东沂水人，农艺师，博士，从事食品安全研究，Email：jiny81@163.com。*通讯作者，博士，从事食品安全与检测研究。

收稿日期20131210量子点（QDs）又称为半导体纳米微晶粒，是一种由Ⅱ～Ⅵ 族元素（如 CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或III～V族元素（如InP、InAs等）组成，直径在1～100 nm的纳米颗粒，目前研究较多的主要是 CdX（X = S、Se、Te）[1-2]。量子点材料早期多应用于物理、电子和材料工程领域，1998年美国加州伯克利大学的Alivisatos 小组和印地安纳大学Nie小组几乎同时提出荧光量子点可应用于生物标记这一观点，开创了荧光量子点在生物技术中研究应用的先河。随后，量子点技术在生命科学、分析科学、材料科学、免疫医学、检验检疫科学等传统及新兴的领域中都得到了广泛的应用。

食源性致病菌引起的食源性疾病是引起食品安全的最大隐患之一，越来越受到各国的重视，而目前已报道的食源性致病菌检测方法都各有其缺陷，为了适应检测需要，不断研究发展灵敏度更高、普遍适用性更好、更为快速简便的新型检测方法就显得非常有意义。笔者重点综述了量子点的特性及其在食源性病原体检测中的研究进展，并对其在今后食品安全检测方面的发展前景予以展望。

1量子点的生物相容性

生物相容性是指材料与生物体之间相互作用后产生的各种生物、物理、化学等反应。即是指材料植入人体后与人体相容程度，是否会对人体组织造成毒害作用。这一概念可以从以下3个方面来解释[3]：一是该材料不仅是简单地存在于生物体内，而必须扮演某一角色；二是该材料对生物体给予的某些反应应该产生回应；三是该材料必须具有普遍适用性。生物相容性包括两大原则[4]：一是生物安全性原则，即生物材料对人体无破坏性；二是生物功能性原则（或称为机体功能的促进作用），指材料在特殊的环境中能够激发生物体恰当应答的能力。

1.1量子点的细胞毒性量子点种类繁多，组成成分不同，因此每种量子点的毒性也不同。目前主要从量子点的暴露途径（职业暴露或自主暴露等）、暴露浓度、量子点的种类、表面修饰试剂的类型和环境因素等方面来研究量子点的毒性[5]。

Derfus等以裸露的CdS量子点和表面带有修饰试剂（巯基乙酸和半胱胺酸）的CdS量子点对人胚肝细胞进行标记[6]。试验结果表明，裸露的CdS量子点在人胚肝细胞中Cd2+的释放率远高于表面带有修饰试剂的CdS量子点的释放率，约为15%～25%，从而对生物体产生毒害作用。其原因可能是Cd2+在细胞外抑制细胞的增殖存活能力，或者是细胞通过吞食作用使量子点进入细胞内，此时Cd2+与细胞直接接触，从而对细胞产生损害作用。

Lovric等研究了CdTe量子点的粒径和浓度对PCl2和Ng细胞的影响[7]。结果表明，量子点的大小决定了其在细胞中的分布。细胞质中以大粒径的CdTe量子点为主，而细胞核中以小粒径的CdTe量子点为主；当不同粒径的量子点在相同浓度下，小粒径和大粒径的量子点对细胞代谢活性的抑制率分别为（46.8±2.3）%和（68.8±1.4）%，表明小粒径量子点的毒性较大。另外，量子点所带电荷不同，对细胞的破坏程度也不相同。

su等比较了K562细胞在CdTe、CdTe@CdS、CdTe@CdS@ZnS 3种水溶性量子点存在下的细胞毒性[8]。研究发现，由于量子点中Cd2+的释放致使CdTe和CdTe@CdS对细胞的毒性较大；而高浓度CdTe@CdS@ZnS量子点长时间与细胞作用，对细胞的毒性小于前2种量子点，这可能是由于最外层ZnS的存在阻碍了Cd2+的释放。这进一步说明了量子点的结构不同，对细胞的毒害作用也不同。

1.2量子点的氧化及降解Derfus等考察了MAATOPOcapped CdSe QDs 对鼠肝细胞的影响[6]。量子点表面的修饰试剂由于光解和氧化作用而发生降解，从而使鼠肝细胞死亡。肝细胞毒性与量子点周围的环境和浓度有关，先将MAATOPOcapped CdSe QDs 暴露在空气或紫外灯下，然后让其与鼠肝细胞相互作用，结果发现，细胞活性显著降低。这可能是由于在氧化和光解条件下引起了MAATOPOcapped CdSe QDs 的分解，使游离Cd2+浓度增加而引起的。

Chen等将二氧化硅包覆的CdSe@ZnS量子点与肽偶联用来研究活体细胞成像[9]。当量子点与细胞的量为比为100∶1006、10∶106 和1∶106时，研究发现该量子点对Hela细胞的存活影响较小。这表明硅壳可以有效地阻止Cd、Se、Zn和S 与细胞核中的蛋白质和DNA之间发生相互作用。

1.3量子点修饰试剂对细胞毒性的影响Hoshino等通过MTT 试验发现，在WTKI细胞内以巯基十一酸（MUA）、L半胱氨酸（LCys）和硫代甘油（MPP）修饰的CdSe@ZnS量子点，由于表面修饰试剂的氧化或在体内酸性条件下脱落而释放到细胞质中，进一步对细胞产生毒害作用[10]。将WTKI细胞与MUA capped CdSe @ZnS QDs或LCyscapped CdSe @ZnS QDs 或MPPcapped CdSe @ZnS QDs培养12 h，量子点剂量大于100 μg/ml时，MUA capped CdSe @ZnS QDs和LCyscapped CdSe @ZnS QDs 均会表现出严重的细胞毒性，而MPPcapped CdSe @ZnS QDs 的毒性几乎可以忽略。而DNA与量子点（>50 μg/ml）培养2 h便可观察到DNA的损伤。

2量子点标记技术在食源性病原体检测中的研究成果

2.1量子点标记技术在细菌污染检测中的研究应用量子点标记技术既可准确检测出食品中致病微生物种类，也可进行定量分析，从而大幅提高食品安全性。

缪婷婷等于2010年将纳米探针技术与荧光分析方法结合应用于DNA杂交分析，以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌特定序列DNA为模式分析物，建立了超微量新型分析方法体系[11]。同时将其作为发光成像标记物，对小鼠不同生理状态下的巨噬细胞成像进行了观察分析，进一步拓宽了量子点的应用。在试验最佳条件下，沙门氏菌目标DNA检出限为20 fmol/L，李斯特菌目标DNA检出限为25 fmol/L，金黄色葡萄球菌目标DNA检出限为22 fmol/L。

Tully等利用量子点标记抗体，通过荧光免疫法测定单增李斯特菌表面结合蛋白来检测单增李斯特菌[12]。Hahn等利用亲合素标记CdSe/ZnS核壳型量子点检测大肠杆菌O157∶H7，检测限可达2.08×107 CFU/ml[13]。

邹明强等结合免疫技术和量子点磁性分离技术，采用便携式光谱仪定量测定大肠杆菌O157：H7，检出限比普通异硫氰酸荧光素（FITC）标记低100倍，分析在2 h内完成[14]。

Wang等利用免疫磁性分离技术检测培养液中单增李斯特菌，首先偶联链霉亲和素的磁性纳米珠与含单增李斯特菌的培养液混合，磁性分离后与偶联量子点混合，通过测定磁性纳米珠-单增李斯特菌-量子点结合物的荧光强度来检测培养液中单增李斯特菌，检测线性范围100～107 CFU/ml，检测限低达2～3 CFU/ml，检测时间为1.5 h[15]。

此外，利用不同颜色荧光量子点标记不同致病微生物抗体，可同步检测食品中多种致病微生物。Xue等利用水溶性量子点标记大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌S.aureus，检测范围为102～107 CFU/ml，检测时间为1～2 h[16]。Yang等利用525、705 nm量子点分别标记大肠杆菌E.coli O157∶H7和伤寒沙门氏菌S.Dphimurium抗体，偶联抗体的免疫磁珠预处理分离后，免疫磁珠-细菌混合物与量子点结合能特异性识别相应的致病微生物，检测限为1×104 CFU/ml，检测在2 h内完成[17]。

2.2量子点标记技术在生物毒素污染检测中的研究生物毒素又称天然毒素，是指生物来源并不可自复制的有毒化学物质，包括动物、植物、微生物产生的对其他生物物种有毒害作用的各种化学物质。生物毒素除对人类的直接中毒危害外，还可以造成农业、畜牧业、水产业的损失和环境危害，因此，检测食品中生物毒素是极其重要的。

Goldman等将重组蛋白结合于CdSe/ZnS核壳型量子点上，再与抗体相连，可用于荧光检测葡萄球菌肠毒素B，检测限为10 ng/ml[18]。Goldman等用不同粒径CdSe/ZnS量子点分别标记抗蓖麻毒素、霍乱毒素、志贺菌毒素l和葡萄球菌肠毒素B的抗体，可在同一块微孔板上实现4种毒素的同时监测，可获得样品中病毒的种类及含量[19]。杨淑平等分别采用巯基乙酸和谷胱甘肽作稳定剂，水相合成CdTe量子点，再包覆CdS制备核壳型CdTe/CdS量子点[20]。以EDC/NHS作交联剂将CdTe/CdS量子点标记到呕吐毒素抗体上，然后用牛血清蛋白封闭抗体。研究发现，谷胱甘肽稳定剂优于巯基乙酸。与CdTe量子点相比，谷胱甘肽修饰的CdTe/CdS量子点其荧光的强度和稳定性分别提高6倍和2倍以上。谷胱甘肽碳链较长，减少了量子点对抗体尤其是活性位点处的空间构型影响，大大提高抗体的稳定性。监测不同储藏时间（4 ℃）的CdTe/CdS量子点-抗体偶联复合物与呕吐毒素免疫反应前后荧光强度变化值，结果显示，抗体至少可以稳定7 d。基于谷胱甘肽稳定的高性能CdTe/CdS量子点，建立一种新的呕吐毒素荧光免疫检测方法。呕吐毒素浓度在0～0.9 ng/ml相对荧光强度呈线性关系，相关系数（R2）为0.999 2，检出限是0.038 ng/ml。方法的灵敏度高于文献报道的其他方法，如GCECD、HPLC和HPLCMS，已成功应用于小麦面粉样品中痕量呕吐毒素的测定。

周晓燕等将谷胱甘肽作稳定剂水相合成CdTe/CdS核壳型量子点，以EDC/NHS为活化剂对黄曲霉毒素B1（AFB1）抗体进行量子点标记，然后用牛血清蛋白封闭抗体[21]。通过对量子点和标记抗体性能的研究发现，CdTe/CdS核壳型量子点荧光的强度和稳定性较裸壳的CdTe量子点分别提高了4倍和2倍以上。由于谷胱甘肽碳链较长，量子点对抗体尤其是活性位点处的空间构型影响减少，从而改善了量子点标记抗体的稳定性和活性，CdTe/CdS标记的AFB1抗体与AFB1免疫前后荧光强度变化显示抗体至少可以稳定6 d。基于谷胱甘肽稳定的高性能CdTe/CdS量子点，建立了一种荧光免疫检测黄曲霉毒素B1的新方法。AFB1浓度在0.68～40 pmol/L，荧光强度与浓度呈线性关系，相关系数（R2）为0.991 4，检出限为0.3 pmol/L。方法已成功应用于米醋样品中痕量黄曲霉毒素B1的测定。

孟元华等建立了一种基于CdSe/CdS量子点（QDs）标记技术测定微囊藻毒素LR（MCLR）的方法[22]。MCLR抗体经1乙基3（3二甲基胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化，与经巯基乙酸修饰的CdSe/CdS量子点进行共价连接，获得的QDs生物共轭体在待测物MCLR的作用下发生荧光猝灭现象，荧光猝灭程度与MCLR的浓度呈线性关系。该方法操作简单、检测速度快、检出限低达6.9×10-11mol/L。

2.3量子点标记技术在其他微生物污染检测中的研究孔潇艺等在2011年以量子点为探针建立简便快速的病原微生物检测方法，采用配体交换法将具有微生物特异性的糖链，偶联到CdSeS/ZnS量子点表面，制备2种糖量子点复合材料（甘露糖-量子点和半乳糖-量子点）。通过对它们的结构、物性和光谱学特性进行表征[23]，结果显示，2种糖量子点均具有良好的水溶性、荧光发射和紫外-可见光吸收性能。进一步以这2种糖量子点为探针与凝集素共孵育后，溶液颜色和荧光发射光谱的变化表明，甘露糖-量子点对刀豆蛋白具有特异性，最低可检测浓度为95 nmol/L；而半乳糖-量子点对蓖麻毒素具有特异性，最低可检测浓度为3 nmol/L。该研究为进一步建立病原微生物的检测方法奠定了基础。

3前景展望

社会的进步和人们生活水平的提高对食品安全检测技术提出了更高的要求，而传统的检测方法在一定的程度上已经不能够满足现有的检测要求。近年来，随着纳米技术的飞速发展和量子点标记技术的日臻完善，量子点在食品安全检测领域的应用显示了巨大的学术价值和良好的商业前景。在这样的前提下，先进的纳米技术与传统检测方法的结合，产生了许多具有检测时间短、检测灵敏度高的检测方法，在很大程度上改变了食品安全检测领域的研究现状。这些方法在检测灵敏度、检测时间、检测样品量等方面都能够很好地满足目前严峻的食品安全检测形势，可以相信，当前先进量子点标记技术与传统的检测方法进一步结合，将研究出更多新型简便可行的检测方法，为食品安全检测与监控的进一步发展提供强有力的技术支持，从而充分保障人民群众日常生活中的食品安全。

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