益生菌在治疗炎症性肠病方面的应用

朱军伟 杭锋 王钦博 宋馨 侯建平

摘要从炎症性肠疾病（IBDs）的发病原因入手，重点阐述了益生菌在调节肠道菌群平衡、维护肠粘膜屏膜功能以及调节肠相关免疫体系平衡缓解和治疗炎症性肠疾病方面的作用机理。

关键词益生菌；炎症性肠疾病；肠道菌群

中图分类号S852.6文献标识码A文章编号0517-6611（2014）01-00124-04

基金项目“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD12B08，2013BAD18B01）。

作者简介朱军伟（1988- ），男，上海人，初级工程师，硕士，从事乳制品研究，Email：juvid.zhu@icloud.com。

收稿日期20131204炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性肠道炎症性疾病，其主要临床形式是克罗恩病（Crohns disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC ）。克罗恩病可以影响胃肠道的任何一个部分，溃疡性肠炎则主要发生在结肠粘液膜。目前普遍认为IBD可能是环境、免疫、遗传以及肠道微生物相互作用的结果。同时，一些抗生素的使用会引起肠道正常菌群的失调，加重炎症反应[1]。以前我国炎性肠病较为少见，但近年来我国IBD患者逐渐增多。

益生菌是一类活的微生物，当摄入一定数量时对宿主的健康有益。研究表明，益生菌在预防和治疗炎症性肠病方面起到有益的作用。乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和肠球菌（Enterococcus）属的一些菌株常被作为益生菌。菌株L.plantarum 299v[2]可以缓解和减轻IL10缺陷小鼠炎症的发生。甲氨蝶呤处理的小鼠口服菌株L.plantarum 299v减少了结肠炎的发生率、降低结肠炎的严重程度[3]。笔者对炎症性肠病的发病原因、益生菌的作用机制及其在预防和缓解炎症性肠病方面的作用等进行了综述，旨在为益生菌制剂的研发提供一定的理论支持。

1炎症性肠病的发病原因

炎症性肠病（IBDs）是强烈和长久的炎症反应。引起炎性肠病的重要原因之一是肠道内菌群失衡，肠道菌群失去多样性，革兰氏阴性菌数量增多。革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）被肠上皮细胞模式识别受体（PRRs）识别，通过核转录因子κB（NFκB）途径激发炎症反应，促炎细胞因子白细胞介素8（IL8）大量表达。长时间的感染导致肠上皮细胞持续释放IL8，高水平的IL8导致中性粒细胞的渗透性增加，最终破坏肠上皮细胞，肠道屏障功能失调，引起永久炎症，甚至引发肠道癌变[4]。抗生素的滥用、饮食构成等因素导致肠道菌群失调，使肠道内腐败菌、致病菌数量增加，致病菌分泌的肠毒素增加肠粘膜通透性，并且致病菌会直接侵袭损伤肠上皮细胞，破坏粘膜的屏障功能、或者破坏宿主细胞质引起炎症性肠病[5]。

采用传统和分子生物技术研究炎症性肠病患者肠道菌群组成，发现肠道有益菌（如双歧杆菌属和乳杆菌属）的细菌数量减少，而有害菌（拟杆菌属和大肠杆菌属的细菌）数量增加，这种生态失调引起肠道中有益菌和有害菌的失衡，从而导致炎症的发生。克罗恩病患者粪便中厌氧菌的数量特别是拟杆菌属细菌比健康个体显著增多[6]。溃疡性结肠炎患者中，结肠粘膜活组织和粪便样品中需氧微生物增加[7]，厌氧菌及乳杆菌的数量减少，同时硫酸盐还原菌大量增加，乳杆菌和双歧杆菌的数量大量减少，使肠道中短链脂肪酸减少，产生过量的硫化氢，阻滞肠上皮细胞对丁酸盐的代谢作用，导致肠粘膜层变薄[8]。

肠道致病菌破坏肠上皮组织及其屏障功能的机制包括诱导宿主细胞死亡，破坏肠上皮细胞紧密连接（TJ）和粘附连接，增加上皮细胞渗透性，降低上皮细胞的跨膜电阻，引起炎症损伤[9]。致病菌还可以通过代谢过程中产生毒素来侵袭宿主细胞[10]。研究表明，益生菌可以有效调节肠道菌群平衡，预防炎症性肠疾病。

2益生菌预防和缓解炎症性肠病的机理

益生菌在肠道中产生有机酸、过氧化氢和细菌素来抑制病原菌和腐败菌增殖，维持肠道菌群平衡；益生菌维持肠粘膜屏障功能，防止病原菌侵袭肠粘膜；促进肠相关淋巴系统发育，调节肠道免疫平衡[11]，从而起到预防和缓解肠炎的作用。

2.1抑制病原菌的生长繁殖IBD的发病与肠道菌群失衡紧密相关，因此维持肠道正常菌群平衡可以预防IBD的发生。益生菌及其代谢产物（如短链脂肪酸及细菌素）可以杀死或抑制致病菌的生长繁殖，同时益生菌还可以抑制致病菌毒素的产生，减少病原菌对肠道的破坏，维持肠道正常菌群平衡和肠道屏障功能，从而预防和缓解IBD。

由葡聚糖（Dextranesodiumsulphate，DSS）诱发结肠炎小鼠服用乳杆菌和双歧杆菌后，抑制了结肠炎小鼠肠道中有害微生物的生长繁殖，这是因为益生菌代谢产生短链脂肪酸，降低了肠道pH，形成不利于病原菌生长的微环境[12]。双歧杆菌代谢产生的醋酸通过调节肠上皮细胞增强肠道防御功能，阻止侵袭性病原菌的入侵，维持肠道中正常菌群的平衡[13]。L.reuteri产生的一种潜在的抗菌物质Reuterin可以阻止肠道中病原菌的过度生长，维持肠道菌群平衡[14]。另外，益生菌还可以通过交互凝集作用使致病菌更容易从肠道中排出。L.coryniformis DSM20001T可以与E.coli K88，Campylobacter coli以及C.jejuni发生共凝集作用，有利于致病菌在肠道中排出[15]。

2.2干扰病原菌在肠上皮细胞的粘附致病菌粘附到肠上皮细胞是引起肠道疾病的第一步，粘附可以使细菌定植在肠粘膜上，引起肠上皮细胞的进一步损伤。益生菌与病原菌竞争粘附位点和营养物质，干扰病原菌在肠道中粘附定植，可以阻止肠道损伤，改善病原菌引起的肠道炎症。菌株L.acidophilus Bar13、L.plantarum Bar10及B.longum Bar33等可以有效抑制S.typhimurium和E.coli在caco2细胞上粘附，减少肠上皮细胞表达IL8，从而预防肠炎的发生[16]。菌株L.rhamnosus 和 L.acidophilus可以阻碍1型痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae 1）在caco2细胞上粘附及侵入细胞，并降低肿瘤坏死因子α（TNFα）和IL8的表达，因此降低了肠炎发生的风险[17]。口服菌株Saccharomyces boulardii的结肠炎小鼠与未服用S.boulardi的小鼠相比，其粘膜粘附的Citrobacter rodentium显著减少，表明S.boulardii通过抑制C.rodentium在肠粘膜上的粘附，从而改善炎症[18]。菌株L.rhamnosus R0011和L.helveticus R0052可以减少小鼠肠腔中微生物的粘附和转移，降低了小鼠患肠炎的风险[19]。体外和体内试验结果均表明益生菌可以干扰病原菌的粘附，保护肠道屏障功能，预防炎症的发生。

益生菌不仅本身具有抑制肠道致病菌在肠上皮粘附的功能，同时其细胞组分也可以抑制肠道致病菌的粘附，从而保护肠上皮免受致病菌的侵袭，保护肠道健康。L.crispatus ZJ001的表面蛋白可以显著抑制E.coli O157∶H7 和 S.typhimurium在HeLa细胞上的粘附[20]。L.plantarum BMCM12分泌的胞外蛋白质可以显著减少肠道致病菌在粘液层的粘附数量[21]。L.kefir中分离的表面蛋白预处理Salmonellal，显著降低了Salmonellal在Caco2上的粘附数以及对细胞的入侵[22]。

2.3肠上皮细胞的屏障功能以及益生菌对其完整性的影响胃肠道的上皮层是消化道与外界接触的主要接触面。肠上皮细胞屏障包括粘液层、上皮细胞以及肠上皮细胞产生的抗菌物质。

研究表明，益生菌可以增强肠上皮细胞的屏障功能，从而抑制病原微生物在肠粘膜上粘附入侵。益生菌可以促进肠上皮细胞防御素、黏蛋白和肠上皮紧密连接相关蛋白的表达，使肠上皮细胞屏障功能得到加强（图1）。

益生菌对肠道具有多种有益作用：①通过产生抑菌物质和竞争粘附抑制病原菌对肠上皮细胞的有害作用；②益生菌通过增强先天免疫、增加抗炎因子的产生和抑制促炎因子的产生，维持机体免疫平衡；③益生菌通过增强肠上皮细胞存活性、屏障功能和细胞保护反应，促进肠上皮细胞稳定[23]。

相邻的肠上皮细胞通过紧密连接（Tight junction，TJ）相互连接，紧密连接对于阻止微生物的渗透以及运输营养物质起着非常重要的作用。肠上皮紧密连接（TJ）主要的连接相关蛋白是ZO1和ZO2，在IBD的炎症过程中细胞因子的产生会引发ZO1的重组，导致肠道渗透性的增加。益生菌会影响TJ蛋白的表达和分布，增强肠道屏障功能。病原菌感染肠上皮细胞后，引起肠上皮跨膜电阻（Transepithelial electrical resistance，TEER）下降，对大分子物质的渗透性增强，增加了病原菌入侵肠组织的机会。菌株L.rhamnosus GG保护上皮单层细胞免受肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）诱导的TJ相关蛋白claudin1和ZO1的重新分布，改善上皮组织渗透性，阻止TEER的下降，可以有效预防致病菌引起的急性腹泻、出血性肠炎以及溶血尿毒性综合征[24]。Heli Putaala等研究表明经不同益生菌发酵上清液处理的Caco2细胞的跨膜电阻都有不同程度增加，阻止了EHEC毒素对肠紧密连接的损伤[25]。益生菌菌体及其发酵产物都对肠上皮细胞的紧密连接有一定的保护作用。在DSS诱发结肠炎小鼠中，occludin、ZO1、claudin1、claudin3、claudin5减少，经混合型益生菌VSL#3处理后，阻止TJ蛋白表达的改变，增强了肠道的屏障功能，有效的保护肠道免受致病菌的入侵[26]。

与正常部位相比，肠道炎症部位的粘膜层较薄，粘附的细菌数增加并且其渗透性增强。益生菌可以促进上皮细胞分泌粘液来提高肠道屏障功能。一些Lactobacillus属益生菌可以促进Caco2（MUC2）和HT29（MUC2和MUC3）细胞系分泌粘液，增强肠上皮屏障功能，从而阻止E.coli的入侵和粘附[27-28]。

革兰氏阴性菌通过NF κB途径激发炎症反应和IL8的大量表达，引发炎性肠疾病。NF κB可以被病原微生物和病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMP）激活，NF κB的激活引起致病菌感染部位的炎性细胞因子表达上调，这些因子是宿主对入侵微生物免疫应答的重要分子，而大量炎性因子的表达将损伤肠上皮组织[30]。益生菌通过产生抑菌物质、诱导肠上皮细胞产生热休克蛋白，或者通过抑制肠上皮细胞NFκB途径的激活来抑制或者减少促炎细胞因子的表达，如抑制促炎细胞因子（包括IL8、TNFα、IL1β）的表达，而促进抗炎细胞因子（IL10）的表达，从而预防和缓解炎症反应[31]。Bifidobacterium和Lactobacillus属的菌株可以显著抑制NF κB途径的激活和IL8的产生，从而抑制和缓解肠炎。菌株L.crispatus K243和K313可以抑制病原菌S.braenderup在肠上皮细胞上粘附，并降低S.braenderup诱导肠上皮细胞产生的IL8水平，因此可用于抑制腹泻性肠炎[32]。

热休克蛋白（Hsp）可以在应激条件下保护细胞存活。热休克蛋白的表达可以减少IL8的分泌，降低炎性因子对肠上皮细胞的损伤作用[33]。肠炎沙门氏菌感染肠道引起急性免疫反应，使IL8炎性细胞因子大量表达，Lactobacillus属菌株及其代谢产物可抑制S.enteritidis增殖及IL8的表达，并促进热休克蛋白（HSP）表达，从而缓解S.enteritidis引起的肠道炎症[34]。

野生型小鼠口服B.breve可以改善结肠炎，但是IL10基因敲除小鼠口服B.breve后则没有这种效果，表明B.breve阻止炎症主要是通过诱导免疫细胞产生抗炎细胞因子IL10[35]。摄食益生菌可以增强调节性T细胞的活性，来增强机体的免疫机能，预防和缓解肠道炎症[36]。健康的志愿者服用含L.acidophilus La1和 B.bifdum Bb12发酵牛乳产品21 d，志愿者免疫细胞对E.coli sp的吞噬能力增强，非特异的和抗感染的免疫防御能力因为服用以上菌株而有所提高[37]。

3展望

分离和筛选具有缓解和预防炎性肠病的益生菌对于改善人类肠道健康大有裨益。从健康人肠道中分离这类益生菌具有可行性。人类肠道来源的益生菌能够适应人体肠道环境，具有安全性，并在其中定殖，发挥应有的益生功能。具有益生作用的菌株L.rhamnosus G.G（LGG）便是从健康人粪便中分离获得的。人们长期食用的传统发酵食品（如传统发酵乳制品（酸奶、马奶酒和奶酪）、肉制品（发酵香肠）和泡菜）中，蕴藏有丰富的乳酸菌，这些乳酸菌具有长期的食用安全性，已有报道从这些发酵食品中分离获得具有益生作用的乳酸菌。笔者多年来一直在进行传统发酵乳制品中乳酸菌的分离和具有益生功能菌株的筛选。分离获得的菌株Lactobacillus coryniformis subsp. torquens T3L和Lactobacillus paracasei supsp.paracasei M5L可以刺激外周血单核细胞（PBMCs）增殖，产生细胞因子IL12、TNFα、IFNγ，并增强自然杀伤细胞（NK cells）活性[38]；另外7株乳杆菌及其表面蛋白可以抑制Shigella sonnei在肠上皮细胞HT29上粘附[39]。目前获得的乳杆菌株可以以抑制E.coli O157在肠上皮细胞caco2上粘附，可以抑制E.coli O157诱导caco2细胞产生IL8，而对其抑制和缓解炎症性肠炎的功能则有待进一步研究。

人体肠道共生菌群、肠上皮细胞与肠相关免疫细胞之间的互动平衡是维持肠道及机体健康的关键，一旦这种平衡被打破，病原微生物大量增殖，诱发炎症性肠病等病症，而肠道炎症也促使肠病原菌大量增殖、破坏肠道正常菌群，最终导致肠道癌变[40]。乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属类益生菌对于预防和治疗炎症性肠病是有效的，它们通过平衡肠道菌群、增强肠粘膜屏障功能及促进肠道免疫平衡，预防和治疗炎症性肠病。不同益生菌株及其产物防止炎症性肠病发生的机制是不同的，并且是不同机制共同影响的结果。因此，需要深入了解益生菌株与肠上皮细胞相互作用的分子机理以及不同菌体成分在菌体与上皮细胞相互作用中发挥的作用。

参考文献

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