酶联免疫吸附法（ELISA）检测猪肉中盐酸克伦特罗

薛金英

盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精）为一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。当其应用量达到治疗量的5～10倍时，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此俗称为“瘦肉精”。在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种和生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质，同时也造成食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。当人们食用盐酸克伦特罗残留的产品后会出现一系列的中毒症状。动物源性食品药物残留问题逐渐引起人们的重视。本法用于定量、定性检测猪肉中盐酸克伦特罗的残留。

1试验原理

采用间接竞争ELISA法，在微孔板上包被抗盐酸克伦特罗检测抗原，样品中的盐酸克伦特罗将和酶标板上的盐酸克伦特罗检测抗原竞争结合盐酸克伦特罗抗体，盐酸克伦特罗检测抗原结合的盐酸克伦特罗抗体再与同时加入的酶标二抗结合，洗涤后，用TMB底物系统显色，微孔板吸光值与样品中盐酸克伦特罗含量成负相关，与标准曲线比较再乘以浓度比值即可得出盐酸克伦特罗在样品的实际含量。

2试验方法（稀释倍数为4倍）

称取1.0 g（±0.05 g）均质样品于50 mL聚苯乙烯离心管中，加入1 mL 0.1 M盐酸，再加入2 mL提取工作液，充分振荡混匀5 min，4 000 rpm（20～25℃）离心10 min。取1 mL上清液加入约25 μL 1 M 氢氧化钠调节pH至6.5～7.5之间，充分振荡混匀，取50 μL用于分析。如果上层中存在白色脂肪层，取样时应避开。

试剂准备：将10×浓缩洗涤液和蒸馏水（或去离子水）按1∶9充分混匀，即为1×洗涤液。

编号：将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。

加样：加入标准溶液或样品50 μL，然后每孔分别加入盐酸克伦特罗酶标二抗50 μL和盐酸克伦特罗抗体溶液50 μL。

温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温（20～25℃）反应30 min。

洗涤：小心揭开封板膜，每孔加入1×洗涤液250 μL洗涤微孔板，连续洗板3次，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。

显色：将底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振荡混匀，每孔加入100 μL，室温（20～25℃）避光显色15 min。

测定：每孔加入终止液50 μL，轻轻振荡混匀，5 min内测定450 nm处吸光度值。

3结果判定

计算B/B0 ：所获得的标准溶液或待测样品的吸光度值除以0号标准溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

式中：B ∶ 标准溶液或待测样品溶液的吸光度值，B0 ∶ 0号标准溶液的吸光度值。

绘制标准曲线，计算样品中盐酸克伦特罗浓度：以盐酸克伦特罗标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中盐酸克伦特罗的浓度。

盐酸克伦特罗实际含量（μg/kg）=C×D

式中：C：稀释后样品提取液中盐酸克伦特罗含量（μg/L），D：样品稀释倍数

注：为获得样品中盐酸克伦特罗的实际含量（μg/kg），从标准曲线上读出的浓度值应当乘以相应的稀释倍数。

4结论

本试剂盒灵敏度为0.1 μg/L，样品最低检测限为0.4 μg/kg，回收率一般在80%～100%之间，为确保结果准确，试验过程中应注意以下问题：

试剂盒保存于2～8℃，不能冷冻，未用的微孔板放回原铝箔袋密封后2～8℃存放，并尽快使用。底物溶液要避光保存。使用之前，将样品及所需试剂的温度平衡至20～25℃，否则可能导致后面检测吸光度值偏低。试剂使用完后应立即放回2～8℃冰箱。不要使用过期的试剂盒，不同批号试剂不能混用；洗板拍干后应立即进行下一步操作，如果洗板后出现板孔干燥，会导致标准曲线线性不好。底物溶液如果变蓝表示已经变质，不能使用。0号标准溶液的吸光值< 0.6时，表示试剂盒已经变质，不能使用。反应终止液为2 M硫酸，应避免与皮肤和衣物接触。（编辑：何芳）