荔枝基因枪转化及其GUS瞬时表达研究

桑庆亮等

摘 要 以幼胚来源的荔枝EC作为受体材料，采用基因枪轰击的方法将外源gus基因转入荔枝，并对不同条件下的GUS瞬时表达进行了详细研究。结果表明：在其它参数不变的条件下，轰击距离、真空度、可裂膜片压力、金粉用量、质粒DNA用量等理化参数显著影响GUS瞬时表达；渗透处理可显著促进GUS瞬时表达。因此，荔枝EC基因枪转化的适宜条件为在轰击距离6 cm、真空度84.66 kPa、可裂膜片压力7 584.23 kPa、轰击1次的情况下，每次轰击用1 μg质粒DNA包裹600 μg金粉对事先用0.25 mol/L前处理4 h的荔枝EC轰击，并在轰击后渗透处理20 h。另外，经50 mg/L潮霉素筛选得到荔枝抗性愈伤组织，并通过体胚发生途径获再生植株，且GUS染色显示获得了稳定表达GUS蛋白的细胞系和植株。

关键词 荔枝；胚性愈伤组织；基因枪；遗传转化；瞬时表达

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Abstract In the paper， plasmid pCAMBIA1301 DNA harboring the gus gene encoding β-glucuronidase， coated on gold particles， was delivered into cultured EC via particle bombardment and transformation was monitored by analyzing GUS transient expression in Litchi chinensis Sonn. The results showed that GUS transient expression level was significantly influenced by physical and chemical factors， such as distance to targets， vocuum pressure， helium pressure， gold particle dosage， plasmid DNA dosage， and vitality of litchi EC cells， which affected by growth stages and osmatic treatment. A suitable particle bombardment procedure was proposed. Litchi EC which was pre-cultured on MS medium with 0.25 mol/L mannitol for 4 hours and post-cultured for 20 hours after bombardment was bombarded once using 600 μg gold particles coated with 1 μg plasmid DNA with a vacuum degree of 84.66 kPa， a bombarded distance of 6 cm， and a rupture disk value of 7 584.23 kPa. Hygromycin-resistant embryonic calli（HREC）and plantlets regenerated from HREC were also obtained and GUS stable expression in HREC and leaves were also examined to confirm transformation.

Key words Litchi chinensis Sonn.； Embryonic calli； Particle bombardment； Genetic transformation； Transient expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.021

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是重要的热带亚热带木本果树，主要分布于中国福建、广东、广西、云南、四川等省以及世界上许多热带亚热带地区，经济价值较高。由于荔枝是多年生的木本植物，遗传背景复杂，传统遗传育种进展缓慢。现代植物组织培养技术和转基因技术的兴起与发展为加速荔枝品种改良提供了强有利的手段。

荔枝组织培养技术的研究始于20世纪80年代。1983年，傅莲芳和唐道一[1]首先从荔枝花粉培养获得再生植株。此后，吕柳新等[2]、周丽侬等[3]均通过荔枝幼胚培养获得再生植株。1997年，俞长河[4]进行了荔枝原生质体分离与培养的工作，并通过体胚发生途径获得再生植株。2000年，Lai等[5-6]对龙眼、荔枝组织培养和体胚发生进行了总结，至此，荔枝再生体系基本确立。欧阳曙等[7]曾用注射器将根癌农杆菌荔枝初生苗与结果树枝条上，经培养获得了愈伤组织，初步证明了T-DNA可用作荔枝基因工程的载体。此后，曾黎辉等[8]均通过农杆菌感染的方式获得了GUS瞬时表达的结果；Puchooa[9]将GFP基因通过农杆菌感染的方法转入荔枝愈伤组织和叶片，但未获得再生植株，Das等[10]通过农杆菌感染的方式将水稻几丁质酶基因转入荔枝EC获得高表达的转基因植株。这些采用农杆菌对荔枝进行遗传转化的研究均出现效率低，转化体系不完善。基因枪法技术具有2大优点[11]：无宿主限制、靶受体类型广泛，为建立高效荔枝遗传转化提供有效途径。为此，在对荔枝EC进行基因枪轰击后，获得了GUS瞬时表达的结果[12]。

本研究在初步基因枪轰击试验的基础上，进一步对影响荔枝胚性愈伤组织（Embryonic calli， EC）转化的因素进行了试验，以优化轰击条件，并筛选得到抗性EC，建立起比较稳定的荔枝转化体系，为荔枝遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试受体材料为由荔枝晚熟优良品种“下番枝”的幼胚诱导并长期继代的松散型EC。供试质粒为带有潮霉素抗性基因（hpt）和β-葡萄糖醛酸酶基因（gus）的载体pCAMBIA1301（由福建省农科院农业遗传工程重点实验室王锋博士提供）。

1.2 方法

1.2.1 质粒DNA提取与纯化 质粒DNA提取参照Green等[13]的方法，纯化后的质粒DNA在-20 ℃下保存备用。

1.2.2 受体材料的预处理 轰击试验前5～10 d，将旺盛生长的荔枝EC接种到附加1 mg/L 2，4-D的MS培养基上于（25±2）℃、光照条件下预培养。轰击前4～8 h将荔枝EC转移到含有甘露醇的渗透培养基上进行渗透处理。

1.2.3 轰击程序 操作采用BioRad PDS-1000/He型基因枪完成。试验CaCl2浓度（2.5 mol/L）、亚精胺浓度（0.1 mol/L）、金粉直径（1 μl）等参数均固定，按仪器使用说明准备金粉和制备微弹。基本轰击参数如下，即真空度84.66 kPa、轰击距离6 cm、可裂膜片压力7 584.23 kPa、每次轰击金粉用量600 μg、每次轰击质粒DNA用量1 μg，0.5 mol/L的甘露醇前处理4 h，后处理16 h，轰击1次。

1.2.4 单因素试验设计 在其他参数固定的情况下，以单因素试验分析了理化因素如轰击次数（1、2、3次）、真空度（50.80、67.73、84.66、91.43 kPa）、轰击距离（3、6、9 cm）、可裂膜片压力（6 205.28、7 584.23、8 963.18 kPa）、每次轰击金粉用量（60、150、300、600、1 200 μg）每次轰击质粒DNA用量（0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg）和与荔枝EC生理活性有关的因素如恢复培养时间（1 h、2 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、14 d和21 d）、渗透处理所用甘露醇浓度（0.000、0.125、0.250、0.500、0.750 mol/L）、渗透前处理时间（0、2、4、6、8 h）以及渗透后处理时间（0、16、20、24 h）对GUS瞬时表达的影响。每次轰击均设不含质粒DNA对照。

1.2.5 GUS瞬时表达检测 参照Jefferson等[14]的方法并稍作改动。待染色荔枝材料（EC、叶片等）转入适量X-Gluc染色液（1 mg/mL X-Gluc，5 mmol/L的铁氰化钾和5 mmol/L亚铁氰化钾，0.1% Triton X-100，用100 mmol/L磷酸盐缓冲液定容）中，置于37 ℃黑暗条件下保温12 h，于解剖镜下观察记录蓝斑数。以一次轰击所有的愈伤组织作为一个GUS瞬时表达单位（Transient Expression Unit，TEU），则GUS瞬时表达水平（Transient Expression Level，TEL）表示为蓝斑数/TEU。

1.2.6 抗性愈伤组织筛选与再生植株 荔枝抗性EC的筛选采用在含50 mg/L潮霉素的MS培养基中暗培养的方式；再生植株经由体胚发生途径，采用在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培养基上暗培养的方式；体胚在无激素含5%蔗糖的MS培养基中暗培养以获得成熟体胚；成熟体胚转至含2%蔗糖的MS培养基上光照培养使体胚萌发成苗。

2 结果与分析

2.1 轰击物理参数对GUS瞬时表达的影响

2.1.1 轰击次数 轰击次数影响受体细胞受损程度，本研究试验了1、2和3次轰击后GUS瞬时表达情况（图1）。结果表明，随轰击次数增加，GUS瞬时表达水平上升，但轰击次数对GUS瞬时表达水平的影响不显著（ANOVA，p>0.05）。

2.1.2 真空度 GUS瞬时表达水平随真空度提高而提高（图2），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。其中，真空度为84.66、91.43 kPa时，GUS瞬时表达水平相差不大[分别为（1 532.00±168.94）个蓝斑/TEU和（1 544.33±115.94）个蓝斑/TEU]，而50.80 kPa时，GUS瞬时表达水平最低[（5.67±3.06）个蓝斑/TEU]。

2.1.3 轰击距离 轰击距离对GUS瞬时表达的影响表现为先增大后降低的趋势（图3），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。其中，轰击距离6 cm时，GUS瞬时表达水平最高[（1 150.00±201.10）个蓝斑/TEU]，9 cm时GUS瞬时表达水平最低[（93.33±12.74）个蓝斑/TEU]。多重比较结果表明，两两轰击距离间差异显著。

2.1.4 可裂膜片压力 可裂膜片压力显著影响GUS瞬时表达水平（ANOVA，p<0.05），且总体上压力越大GUS瞬时表达水平越高（图4）。其中，7 584.23 kPa的压力下，GUS瞬时表达水平最高[（1 876.33±105.46）个蓝斑/TEU]，8 963.18 kPa的压力下次之[（1 535±71.08）个蓝斑/TEU]，6 205.28 kPa压力时最低[（145.67±13.05）个蓝斑/TEU]。多重比较发现，3种压力两两之间GUS瞬时表达的差异均显著。

2.1.5 每次轰击金粉用量 金粉用量对GUS瞬时表达的影响也表现为先增高后下降的趋势（图5），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。其中，金粉用量600 μg时GUS瞬时表达最强[（2 426.00±553.26）个蓝斑/TEU]，而每次轰击60 μg金粉时GUS瞬时表达最差[（340.00±80.62）个蓝斑/TEU]。但多重比较结果表明，金粉用量300～1 200 μg之间，GUS瞬时表达两两之间并无明显差异。

2.1.6 每次轰击质粒DNA用量 质粒DNA用量对GUS瞬时表达的影响表现为先提高后下降的趋势（图6），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。其中，质粒用量0.5 μg时，GUS瞬时表达水平最高[（2 159±249.51）个蓝斑/TEU]，无质粒DNA时无GUS表达（图11-A和B）。多重比较发现，质粒用量0.2～1.5 μg范围内，GUS瞬时表达的差异不显著。

2.2 生理因素对GUS瞬时表达的影响

2.2.1 恢复培养时间 GUS瞬时表达水平随恢复培养延长而逐渐下降（图7），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。轰击后1～2 h，GUS无瞬时表达（检测到0个蓝斑/TEU）；1 d左右，GUS瞬时表达水平最高[（1 462±116.38）个蓝斑/TEU]，随后GUS活性逐渐衰退，到7 d时已经很微弱[（96±10.71）个蓝斑/TEU]；14、21 d，蓝斑数极少[分别为（16.67±2.62）、（6.33±1.70）个蓝斑/TEU]。多重比较结果也表明，轰击后1 d显著高于2～21 d时。

2.2.2 甘露醇浓度 随甘露醇浓度增高，GUS瞬时表达水平呈先上升后下降的趋势（图8），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。其中，0.25 mol/L的甘露醇，GUS瞬时表达水平最高[（1 576.67±131.79）个蓝斑/TEU]，未经甘露醇处理的荔枝EC中GUS瞬时表达水平最低[（31.67±6.11）个蓝斑/TEU]，表明甘露醇处理是影响基因枪轰击后GUS瞬时表达的重要因素。

2.2.3 渗透前处理时间 其它轰击条件固定，以0.25 mol/L的甘露醇作为渗透剂，随渗透前处理时间增加，GUS瞬时表达水平呈先增高后下降的趋势（图9），但差异不显著（ANOVA，p>0.05）。其中，4 h前处理，GUS瞬时表达最高[（1 155.33±274.38）个蓝斑/TEU]，未进行前处理，则GUS瞬时表达水平最低[（760.00±143.06）个蓝斑/TEU]。

2.2.4 渗透后处理时间 固定甘露醇浓度为0.25 mol/L，渗透后处理可明显促进GUS瞬时表达（图10），且差异显著（ANOVA，p<0.05）。多重比较结果显示，无渗透后处理，则GUS瞬时表达水平[（430.33±74.85）个蓝斑/TEU]显著低于有渗透后处理的GUS瞬时表达水平，而后处理16、20、24 h的荔枝EC中GUS瞬时表达水平无显著差异。

2.3 抗性EC筛选与再生植株

经50 mg/L潮霉素筛选3个月，得到荔枝抗性愈伤组织（Hygromycin-resistant embryonic calli，HREC），取少量HREC于X-Gluc染色液中浸泡，稳定显蓝色（图11-C）；置于倒置显微镜下可观察，发现HREC内部被染成蓝色的组织（图11-D），表明荔枝HREC可稳定地表达GUS蛋白，即本研究通过基因枪轰击的方法获得了稳定转化的细胞系。

在含有5 mg/L玉米素和5%蔗糖的MS培养基上，暗培养约1个月即可得到大量白色体胚。将白色体胚在含10%椰子汁和5%蔗糖的MS培养基上暗培养，经2～3个月暗培养，得到了直径0.5～1.0 cm的成熟体胚。转入无激素MS培养基上，光照培养1～2个月得到了荔枝抗性EC的再生植株（图11-E）。将再生植株的叶片切成细小条状进行GUS活性检测，切口明显染成蓝色，可以初步确定为转基因植株（图11-F）。

3 讨论与结论

3.1 优化理化因素可以明显提高转化效率

各理化因素影响转化效率的机制是对轰击强度与细胞损伤程度这对矛盾的权衡中实现的。一方面，提高真空度、缩短轰击距离、提高可裂膜片压力会提高微弹的速度，能有效地将外源DNA送达准确的位置；另一方面，轰击强度增加必然带来生物材料受损程度提高，随轰击后时间的延长，大量细胞死亡，造成GUS瞬时表达水平下降。反之，如果真空度下降、可裂膜片压力下降，GUS瞬时表达水平下降，可能的原因是只有少量外源DNA能够到达准确位置。

本研究发现轰击距离、可裂膜片类型、DNA用量、金粉用量、真空度等理化因素均显著影响GUS瞬时表达水平，而轰击次数、对GUS瞬时表达影响不大。这些理化因素的水平通过影响受体材料的生理状态来影响GUS瞬时表达水平。Rasco-Gaunt等[15]认为较低压力下，金粉分散面积大且均匀，对细胞伤害小，而高压力下金粉分散面积小且对细胞伤害大，造成GUS瞬时表达水平下降且不均一。

本研究中还发现，相对较强的轰击条件（比如更高的真空度）对GUS瞬时表达有利，这一结论与Folling等[16]的看法相似。

3.2 改善受体材料的生理活性有助于提高转化效率

一般认为生理活性高的组织或细胞，其DNA活跃，有利于外源DNA的摄入与融合，且受体细胞DNA的活跃程度与渗透压有关。已有研究证实，渗透处理可增强瞬时和稳定表达水平[17-19]。本研究发现，甘露醇渗透处理使荔枝EC轰击后GUS瞬时表达水平显著提高，证实了上述说法。

渗透处理提高转化效率的可能原因：前处理可能使细胞发生质壁分离，轰击时原生质体免受损伤[17]；后处理则为受损细胞提供有利的膜修复环境，促进受损细胞恢复。但是，本研究中高浓度甘露醇（0.5 mol/L和0.75 mol/L）处理的效果均较较低浓度甘露醇（0.25 mol/L）处理的效果差，且渗透处理时间过长GUS瞬时表达水平也会下降，表明渗透处理时间以及渗透剂浓度是非常重要的，如果时间过长或浓度过高，同样会对受体细胞产生较大的影响，从而影响其活力，进而影响其遗传转化。

3.3 荔枝EC基因枪转化的意义

3.3.1 荔枝HREC是很好的细胞学研究材料 细胞生物学与细胞遗传学研究中，细胞融合是非常有用的技术手段，但近缘物种之间由于基因组存在很大的相似性，以自身基因或DNA序列作为鉴定标记难以区分，利用报告基因进行鉴定是可行的。如黄枝英等[20]利用本研究得到的HREC分离原生质体并高频获得再生植株，黄浅[21]用上述原生质体细胞系与龙眼进行细胞融合试验。

3.3.2 稳定的瞬时表达体系为基因功能研究提供重要手段 瞬时表达分析是对基因产物的功能进行分析时不可或缺的重要手段。虽然在植物中，农杆菌可以用于许多物种的瞬时表达分析，但是对于荔枝来说，仍然不适用。基因枪技术可以稳定地将外源基因导入植物组织，并借此研究基因产物的生物学功能和亚细胞定位。这一过程一般在1周内完成[22]，因而本研究建立的高效基因枪转化体系在荔枝及近缘种基因功能研究中具重要意义。

3.3.3 拓宽荔枝转基因受体材料的范围，促进荔枝遗传改良 由于荔枝是多年生木本植物，遗传背景复杂，成体的优良性状很难在下一代植株中保持，使用叶、茎尖、侧芽等成体材料意义重大，因此，改进组织培养技术拓宽荔枝转基因受体材料的范围是促进荔枝遗传改良的基础，近年这方面的研究取得了一定的成果[23-26]，但大规模再生植株仍存在较大困难。一旦再生体系得以建立，利用基因枪法转化荔枝EC的优化程序，就有可能在短时间内通过转基因方式对荔枝品种进行遗传改良。

致 谢 本研究的部分内容在福建省农科院遗传改良重点实验室完成，并得到王锋博士的大力支持与帮助，谨致谢忱！

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