白木香查尔酮合酶基因AsCHS1启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定

曹天骏等

摘 要 利用染色体步移法克隆了白木香查尔酮合成酶基因（AsCHS1）ATG上游1 082 bp的启动子序列，该启动子序列中AT含量高达69.03%，符合真核生物启动子的序列特征。通过启动子预测软件分析可知，该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处，并且其上游-25～30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件，同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element等激素调控元件，光应答元件BoxⅠ、G-Box、ACE，厌氧诱导元件ARE等。通过构建pC-1 082proAsCHS1植物表达载体，借助农杆菌将重组载体转化到烟草叶片中。蛋白定量结果表明，该序列可以驱动GUS的表达，具有启动子活性；脱落酸显著增强该启动子的活性，乙烯则显著抑制该启动子的活性。

关键词 白木香；查尔酮合酶；启动子；染色体步移；瞬时表达；GUS

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A

Abstract Based on the Genome Walker strategy，an approximately 1 082 bp sequence was obtained from the DNA of Aquilaria sinensis. Sequence analysis showed that this promoter region contained a TATA-box core element，a CAAT-box， and other cis-acting elements，including an GARE-motif，a TCA element，CGTCA-motif，G-Box，Box I，and a ARE element； these elements are involved in gibberellin responses，salicylic acid responses，methyl jasmonate responses，light response，respectively. The 1 082 bp promoter sequence was inserted in pCAMBIA1381Z vector to construct a fusion vector containing the promoter connected to the GUS gene. GUS quantitative analysis of transgenic Nicotiana benthamiana carrying the pC-1 082proAsCHS1 vector showed that the promoter was active in the leaves. It also showed high activity in the group treated by abscisic acid， while restrained activity in the group treated by ethylene. These results suggest that AsCHS1 may be regulated by this two phytohormones.

Key words Aquilaria sinensis；Chalcone synthases；Promoter；Genome Walker；Transient expression；β-Glucuronidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.012

沉香是沉香属植物，为含树脂的木材，是中国、印度、日本及其他东南亚国家的名贵药材和天然香料。白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]是中国沉香的唯一基源植物[1]。白木香主要分布于中国的海南、广东、广西、福建、台湾[2]。由于沉香价值高，长期以来白木香遭到掠夺式砍伐，其原始森林已经基本破坏殆尽。因此，白木香已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ[3]。

作为药材，沉香可用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等[4]。对沉香的化学成分研究表明，其主要含有2类成分，即倍半萜类化合物和色酮类化合物[5]，而未经伤害诱导的白木香植物茎干部位则含有大量黄酮类化合物[6-8]。由于色酮类化合物和黄酮类化合物都含有苯并吡喃酮的结构[9]，因此推测沉香中色酮类化合物的产生可能与白木香植物中的黄酮类化合物具有相关性。

查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是合成黄酮类化合物的关键酶之一，催化香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成苯基苯乙烯酮。查尔酮合成酶基因在许多植物中已有克隆并进行了相关研究，如矮牵牛、雪莲等[10]。查尔酮合成酶也作为苯丙氨酸代谢中的关键酶参与植物防御反应[11]。汪孟曦等[12]克隆了白木香查尔酮合成酶基因AsCHS1，AsCHS1在白木香茎干中可提前响应逆境胁迫。目前对白木香中黄酮类化合物的研究也只局限于化学成分的分离纯化与结构鉴定，关于AsCHS1的表达调控机制尚不清楚。自然条件下沉香的形成所需时间很长，且含量低，探索提高沉香产量的方法对充分利用白木香资源具有重要意义[13]。

本研究利用染色体步移法克隆了AsCHS1启动子，并利用瞬时表达系统对其功能进行初步鉴定，这为进一步研究AsCHS1的表达调控机制及阐明白木香受损伤后其类黄酮物质的累积情况奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白木香茎组织采集于中国热带农业科学院热带生物技术研究所区内五年生白木香树；本生烟草（Nicotiana benthamiana）种子、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、pCAMBIA1381Z植物表达载体均由本实验室保存；用于构建染色体步移文库的试剂盒LA PCRTM in vitro Cloning Kit、pMD19-T载体、限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶和X-gal等均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司；普通质粒小提试剂盒购自Real-Times公司。

1.2 方法

1.2.1 染色体步移文库的构建 白木香DNA的提取参照赵翾等[13]的方法进行。染色体步移文库的构建按照TaKaRa公司 LA PCRTM in vitro Cloning Kit使用说明书进行： （1）使用7种产生粘性末端的限制性内切酶（Sau3AI、HindⅢ、EcoRI、MflI、XbaⅠ、EcoT22I、BamHI）分别对白木香树基因组DNA进行酶切消化，使用75%酒精对酶切消化后的DNA进行沉淀并纯化； （2）把纯化的DNA与试剂盒提供的接头连接，构建成7种染色体步移文库（Sau3AI库、HindⅢ库、EcoRI库、MflI库、XbaI库、EcoT22I库、BamhI库）。

1.2.2 引物的设计 根据AsCHS1的序列（GenBank登录号：EF103196.1）依次设计6条反向特异引物，并以试剂盒提供的引物C1、C2作为正向引物进行巢式PCR，设计的引物见表1。

1.2.3 AsCHS1启动子的克隆 第1轮PCR反应：在7个0.25 mL的PCR管中分别加入7种DNA文库0.5 μL，然后分别依次加入10×LA PCR 缓冲液Ⅱ 2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，引物C1 1 μL，引物S1 1 μL、LA Taq 0.5 μL，补水至20 μL；PCR反应程序：94 ℃预变性3 min， 94 ℃ 30 s，54 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。第2轮PCR反应：分别取第1轮PCR产物1 μL稀释100倍作为第2轮PCR反应的模板，然后依次加入10×LA PCR缓冲液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的d NTP 2 μL，引物C2 1 μL，引物S2 1 μL、LA Taq 0.5 μL，总反应体系为20 μL；PCR反应程序：94 ℃预变性3 min， 94 ℃ 30 s，56 ℃ 2 min，72 ℃ 80 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物回收、纯化后克隆至pMD19-T载体上并送北京诺赛生物技术有限公司测序。

1.2.6 植物表达载体转化烟草 （1）将构建好的重组质粒、pCAMBIA1381Z质粒分别用电融合法导入农杆菌GV3101感受态细胞中，于30 ℃恒温培养箱中培养36 h，挑取单菌落，使用pCAMBIA1381Z载体引物PCR验证阳性克隆； （2）将验证正确的单菌落扩大培养，直至至OD600=0.6～0.8，收集菌体后加悬浮液（MES+MgCl2+AS）静置2 h，采用农杆菌介导的真空渗透法转化本生烟草，于28 ℃光照气候培养箱中培养24 h； （3）分别向其喷洒工作浓度为50 μmol/L的乙烯（ET）、赤霉素（GA）及100 μmol/L的脱落酸（ABA）、 茉莉酸甲酯（MeJA）、 水杨酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）， 确保每片叶上均匀覆盖各激素后，再次放入28 ℃光照气候培养箱中培养24 h，检测GUS蛋白活性。

1.2.7 GUS活性检测 （1）取0.1 g烟草样品用液氮磨成粉末，将粉末转移至1.5 mL离心管，加入400 μL蛋白抽提缓冲液[50 mmoL/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.1% Triton X-100、0.1% SDS、10 mmoL/L β-巯基乙醇、10 mmoL/L Na2-EDTA]，混匀，冰上静置10 min，以12 000 r/min离心10 min后吸取上清，此上清即为总蛋白提取液；（2）采用Bradford[14]的方法测定总蛋白浓度，将总蛋白提取液与考马斯亮蓝溶液反应，用酶标仪测定其总蛋白浓度 （3）采用Jeferson等[15]的方法测定GUS蛋白活性，结果以所生成的4-MU的量与总蛋白含量和时间的比值表示（pmol/mg·min）。所有试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 染色体步移文库的构建

白木香DNA经7种限制性内切酶酶切后，凝胶电泳均呈现弥散状分布（图2），表明DNA酶切充分。回收酶切后的DNA并将其与试剂盒提供的接头连接，构建成染色体步移文库。

2.2 AsCHS1启动子的克隆

通过3次巢式PCR克隆到1 082 bp的启动子（图3），序列分析表明该启动子有101 bp的序列与NCBI数据库中AsCHS1的翻译起始位点下游的序列完全一致，表明克隆到了转录起始位点上游1 082 bp的AsCHS1启动子序列。

2.3 AsCHS1启动子功能元件预测分析

对所获得的1 082 bp AsCHS1启动子序列进行功能元件预测分析表明，核心启动子区域位于-106～-66 bp处，其可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游65 bp处。采用Plant CARE数据库和植物顺式元件查询数据库PLACE，对AsCHS1启动子的顺式作用元件进行分析，结果显示（图4）该序列具有启动子核心序列TATA-box和增强子元件CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件；激素相关元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif以及水杨酸应答元件TCA-element等参与激素调控。同时还存在光应答元件BoxⅠ、G-Box、ACE（表2）。

2.4 植物表达载体的构建

对构建的pC-1082proAsCHS1载体质粒进行HindⅢ和SalⅠ的单酶切和双酶切验证，结果如图5所示，单酶切结果线性化，双酶切出现了插入的1 082 bp的片段，表明了载体质粒构建成功。

2.5 AsCHS1启动子激素元件功能的初步鉴定

经GUS蛋白定量检测后发现，与作为对照的水处理组及pCAMBIA1381Z空载体相比，插入该启动子片段后能够显著地驱动载体上GUS蛋白的表达。激素处理结果表明，ABA对AsCHS1启动子的活性有显著的增强作用，ET对该启动子的活性有显著的抑制作用，而MeJA、SA、GA和IAA对AsCHS1启动子的活性没有明显的影响（图6）。

3 讨论与结论

启动子是基因的一个重要组成部分，控制基因表达的起始时间和表达的程度，启动子顺式作用元件的分析与挖掘对研究基因表达调控具有重要的作用[30]。本研究首次克隆了AsCHS1的启动子，通过启动子预测软件分析可知，该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处，并且其上游-25～-30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件，同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件。本研究发现ABA对AsCHS1启动子活性有增强功能，ET（乙烯）对该启动子活性有抑制功能，这与启动子功能元件预测结果不同，原因在于预测的结果是通过模式植物中已知的顺式作用元件推断的，但同种响应元件可能有多种不同的碱基序列，这些非特异的序列并未挖掘完全。

此外，查尔酮合成酶是苯丙氨酸代谢途径中重要的限速酶，控制着植物中黄酮类物质和花青素的合成，其在白木香中的表达情况可能会对沉香的形成及品质造成影响。激素处理对植物体内黄酮类物质的累积具有促进效应，郭磊等[31]发现使用ABA处理桃果实后显著促进了查尔酮合成酶基因（CHS）的转录水平，促进花色素苷的合成，从而促进了桃果实的着色。田晓艳等[32]也发现脱落酸对南果梨的色素累积起作用。而关于ET对查尔酮合成酶表达的影响则很少有报道，乙烯对果实着色的促进作用主要体现在花青素合成代谢途径的支路上[33-34]。因此本研究为通过激素处理来提高白木香中黄酮的含量提供了参考依据。

通过改变植物次生代谢产物合成途径中的关键酶基因的表达来提高次生代谢物的产量已有报道[35-36]，如在青蒿中过量表达法尼基焦磷酸合成酶基因，青蒿素的含量与对照相比提高了4倍[37-38]；健康的白木香植株并不产生沉香，只有通过自然因素（雷劈、火烧、虫蛀等）或人为因素（砍伤、打洞、接菌等）的作用，沉香才会在植物中逐渐积累形成。通过对白木香AsCHS1启动子激素元件的深入研究，将通过激素刺激等直接或间接提高AsCHS1的表达，从而摸索出能够产生更多类型丰富的黄酮类次生代谢产物的方法，为探索白木香中黄酮类物质产生和累积的原理提供依据。同时，在启动子水平上，挖掘逆境下白木香查尔酮合成酶参与防御反应的高表达机理，可为阐明白木香茎干部位细胞响应伤害胁迫和黄酮类物质累积的分子机理奠定基础。

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