橡胶树无性系产胶能力株间一致性分析

包杰等

摘 要 橡胶树无性系株间产量存在明显差异是导致产量育种选择周期长的主要原因之一。橡胶树的产量主要取决于产胶能力和排胶能力2个因素。树干树皮中的次生乳管数量及乳管细胞内的天然橡胶生物合成效率与产胶能力直接相关。从次生乳管分化和橡胶合成关键因子基因表达2个层面对无性系株间产胶能力的一致性进行分析。结果表明：树皮最内石细胞群以内次生乳管列数与次生韧皮部厚度的比值具有品系特征；在同一品系中，该比值的株间差异小，表现出良好的一致性。8 a割龄大树该比值的株间一致性较3 a幼树差，而在3 a幼树中，树高40 cm处该比值的株间一致性比树高100 cm处更好。因此，以3 a幼树树高40 cm处的该比值作为产量育种早期筛选标记较合适。胶乳中MYC1、HRT2基因的表达量在割胶后上调，并且具有品系特征，但这2个基因的表达量在株间的一致性较差，故在产量育种早期筛选中只能起到辅助作用。

关键词 橡胶树无性系；产胶能力；石细胞；次生乳管；MYC1/HRT2基因表达

中图分类号 S667. 3 文献标识码 A

Abstract The obvious difference of latex yield in rubber tree clones is one of the main reasons leading to the long selection cycle in yield breeding. It is well known that the latex yield of rubber tree depends on the ability of latex biosynthesis as well as latex flow， and the latex biosynthesis is determined by two key factors， one of which is the amount of secondary laticifer line in bark and the other is the effeciency of latex regeneration in laticifers. From secondary laticifer differentiation and key gene expression of rubber biosynthesis two aspects， the consistency of latex production capacity in rubber tree clones was studied. The results showed that the ratio of the number of secondary laticifer lines and the thickness of phloem within the innermost stone cell group was a feature closely related with the clones. The standard error of aforementioned ratio much less than the laticifer line number showing well consistency of the ratio in clones. Moreover， the ratio and its standard error changed according to the tree-age and the height of tree. Usually， consistency of the ratio in bark of rubber tree exploited for 8 years was inferior to the 3 years old tree， in which， however， consistency of the ratio in the bark at 40 cm height was better than 100 cm height. So， the ratio of bark at the height 40 cm for 3-year old could be used as an early screening marker for yield breeding. Gene expression of MYC1 and HRT2， possessing clone characteristic， was upregulated after tapping. However， the consistence of expression was low among clones. We proposed that the expression of the two genes may act as an assistant marker in the yield breeding.

key words Rubber tree clones；Rubber production capacity；Stone cells；Secondary laticifer；MYC1/HRT2 gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.013

橡胶树的产量形成受多种因素的影响，产量育种周期长，筛选产量早期选择指标对于缩短育种年限及发展天然橡胶产业具有重要意义。橡胶树树干树皮中的次生乳管数量、2次割胶间的胶乳再生（主要是橡胶生物合成）和排胶持续时间是决定天然橡胶产量的3个关键因子[1]。前2个因子与产胶能力相联系，后一个因子反映了橡胶树的排胶能力。维管形成层的纺锤状原始细胞分化形成次生乳管，因此维管形成层分化乳管的能力直接决定次生乳管的数量。最内层石细胞群以内的次生乳管列的数量与次生韧皮部厚度的比值反映了形成层细胞分化次生乳管的能力，而且与胶乳产量是显著正相关[2]。天然橡胶的生物合成是一种典型的植物类异戊二烯代谢，其关键酶是橡胶转移酶（HRT）[3-6]。茉莉酸对植物次生代谢有重要的调节作用[7-9]。近年来，关于植物茉莉酸信号途径的研究取得了明显进展，鉴定了MYC等关键环节[10-11]。已有研究结果表明，乳管细胞中的天然橡胶生物合成主要受茉莉酸信号途径调节（本实验室尚未发表资料）。本研究从次生乳管分化和橡胶合成关键因子基因表达2个层面对无性系株间产胶能力的一致性进行分析，旨在为橡胶树无性系产量性状早期选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取定植3 a、径围一致的无性系热研7-33-97、热研8-79各5株，于树高40、100 cm处的树干上分别采集树皮制备石蜡切片。开割口收集胶乳，冰上保存。

于儋州国营农场大石村二队选取8 a割龄、长势良好的无性系热研7-33-97、热研8-79各5株，分别收集胶乳和采集割口附近的树皮。

1.2 方法

1.2.1 显微制片观察 参照史自强等[12]的方法。树皮标本分割后用80%（V/V）的酒精固定24 h，梯度酒精脱水，碘-溴染色后石蜡包埋，制备石蜡切片。切片机为Leica RM2235，切片厚度为15 μm。德国Leica DMLB型显微镜观察并拍照。

1.2.2 荧光定量PCR 分别对3 a幼树和8 a割龄胶树胶乳中的MYC1、HRT2基因的表达情况进行分析，材料处理如下：（1）选取茎围一致的热研7-33-97、热研8-79 3 a树各5株，开割线后，采用3 d一刀的割制，分别收集第一刀、第二刀的胶乳并提取RNA。 （2）选取割龄8 a、长势一致的热研7-33-97、热研8-79各5株，采用常规割制割胶，收集胶乳并提取RNA。

对胶乳中HblMYC1（GenBank： HM590649.1）、HRT2（GenBank： AB064661）[13]的表达情况进行荧光定量分析。定量分析基因引物参照赵悦[14]的博士论文，用于定量分析的内参基因为yls8[15]，所用的引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 乳管分化能力株间一致性分析

对热研8-79和热研7-33-97乳管分化情况进行分析，结果表明，在3 a幼树中，最内层石细胞群以内的次生乳管列数（a）在不同品系之间存在差异，并且同一植株在树干的不同部位次生乳管列数也存在差异。通常树高100 cm处次生乳管列数略少，而树高40 cm处次生乳管列数有所增多（图1-A、B、E、D）。在割龄8 a的大树中，热研8-79和热研7-33-97在割线部位的最内层石细胞以内次生乳管列数存在显著差异（p<0.05），热研8-79显著增多（图1-C、F）。对同一品系、同一树龄不同植株间的乳管列数进行比较，发现株间有明显差异。可见，次生乳管列数虽然能反应品系特征，但在同一品系内株间及植株的不同部位一致性较差，未能很好的反映次生乳管分化的能力。

为了更直观的显示树皮a的株间差异，在此对a值的变异系数进行了分析。由图2可知，无性系热研7-33-97 3 a幼树中a值的株间变异系数较大，同一植株不同部位的差距也较明显，其中树高40 cm处比树高100 cm处明显偏低。在割胶大树中株间a值的变异系数显著增大，约为3 a幼树的2倍。在热研8-79中，3 a幼树中a值的变异系数较小，约为10%，不同树高之间差异不明显；但割胶大树中a值的变异系数大，高约35%。由此可见，割胶大树中乳管列数株间差异极大，该参数不适合作为产量育种早期筛选的标记。与大树相比，3 a幼树中乳管列数的株间差异减小，但变异系数还是接近10%，因此寻找一个能充分体现乳管分化能力而且株间一致性更好的指标尤为必要。

为了消除树皮厚度等因素给统计a带来的差异，a值与该部分次生韧皮部厚度（b，单位mm）的比值（a/b）被引入到统计中。无性系热研7-33-97 3 a幼树在树高40、100 cm处的a/b值相近，并且较低，大约为5；但在割胶大树中a/b值出现了明显的增加，大约为9。SAS分析结果表明，二者之间有显著差异（p<0.05）。热研8-79 3 a幼树树皮中a/b值较高，至少为8，不同树高该值的差异不明显，并且与割胶大树的值差距小，3个部位之间无显著差异（p>0.05）（图3）。对2个品系进行比较分析，结果表明，热研8-79在幼龄的阶段就有很好的乳管分化能力，充分体现了该品系的早熟特征。

进一步分析a/b值的株间变异系数。由图4可知，对于无性系热研7-33-97，3 a幼树树高40 cm处株间a/b值的变异系数最低，约为6%；树高100 cm处及割胶大树该系数都增大，但不超过14%。无性系热研8-79中，3 a幼树树高40 cm处a/b值的变异系数最低，仅为4%左右，而树高100 cm处及割胶大树该系数约为10%。

由以上结果可知， 在同样的材料中a/b值的变异系数都低于a值的变异系数，a/b值能更好的消除株间差异，体现品系内的一致性。与大树相比，3 a幼树树高40 cm处树皮中的a/b值不仅能充分体现品系的乳管分化特征和能力，而且具有更好的株间一致性，因此认为该值可作为产量育种早期筛选的标记之一。

2.2 基因表达一致性分析

对MYC1、HRT2基因的表达量进行分析，结果表明，热研7-33-97 3 a幼树割胶后，胶乳中的MYC1、HRT2基因表达量均明显上调；在割胶大树中，胶乳MYC1基因表达量进一步加大，但胶乳HRT2基因表达量明显低于3 a幼树。在热研8-79中，胶乳MYC1基因表达量在3 a幼树中受割胶上调，割胶大树中表达量比3 a幼树更高；而胶乳HRT2基因的表达量在3 a幼树、割胶大树中差异不明显，且都维持高表达（图5）。

对无性系热研7-33-97和热研8-79进行比较可知，无论在 3 a幼树中还是割胶大树中，热研8-79胶乳MYC1、HRT2基因的表达量普遍高于热研7-33-97，尤其是在割胶大树中，HRT2基因的表达量二者差异达到显著水平（p<0.05）。由此可见，胶乳MYC1、HRT2基因的表达量具有品系特征（图5）。

为了进一步分析胶乳中MYC1、HRT2基因表达量在产量育种中应用的潜力，对其品系内的株间一致性进行了分析。在热研7-33-97中，MYC1、HRT2基因的表达量的变异系数在3 a幼树第一刀时皆高达40%，可见一致性很差；第二刀的变异系数较第一刀明显降低，但也有10%以上。大树中MYC1变异系数约为20%，但HRT2的变异系数接近50%。热研8-79中2个基因表达量变异系数在3 a幼树割胶第一刀时差异较大，MYC1约为45%，而HRT2的变异系数约为20%；第二次割胶后，MYC1基因表达量变异系数降低至30%，HRT2的变异系数变化不大。割胶大树中2个基因表达量变异系数都高达40%以上。可见，胶乳MYC1、HRT2基因的表达量在品系内株间的一致性差（图6），因此2个基因均不适合作为产量育种早期筛选的标记。

3 讨论与结论

从橡胶树产量育种中寻找与产胶能力密切相关的指标尤为重要，目前人们主要是从胶乳生理参数和产排胶特性等方面进行分析[17-19]，其结果对于筛选新的高产品系具有一定的作用。但由于这些生理参数通常是综合性的指标，很难直接筛选出可供直接利用的种质材料[20]。另外，种质内株间差异大也导致需要大规模和长时间的品种筛选，因此，寻找与具体性状相关的并且株间一致性好的标记对于缩短育种周期具有重要的意义。本研究主要以树皮中乳管分化的能力和橡胶生物合成关键基因的表达为研究对象，从这2个层面对品系内株间产胶能力一致性进行了分析。

在无性系热研7-33-97和热研8-79中，不同树龄、不同部位树干树皮a值和a/b值都具有品系特征，卢世香等[2]对这些参数与产量之间的关系也进行了初步研究，但对参数的株间一致性分析欠缺。本研究结果表明，品系内株间树皮a值的变异系数大，说明该值的株间一致性较差，不适合作为产量育种早期选择标记。a/b值不仅能充分体现品系乳管分化能力和特征，而且能减少由于不同植株的树皮厚度不同造成的乳管列数统计差异大的现象，材料中a/b值的变异系数比a值的变异系数明显降低，可见该值具有更好的株间一致性。因此，a/b更适合作为产量育种早期选择的标记。不同的树龄及树干不同的高度对a/b值也存在影响，3 a幼树树高40 cm处该值稳定，株间一致性好，所以可作为产量育种早期筛选指标之一。

胶乳中一些特异表达的基因和橡胶产量相关[21]，但这些基因表达量在品系内株间的一致性如何并不是很清楚。根据茉莉酸信号途径和橡胶生物合成途径[22-23]，笔者筛选出MYC1、HRT2基因进行分析，结果表明，胶乳中MYC1、HRT2基因表达量受割胶调控，且热研7-33-97胶乳中MYC1、HRT2基因的表达量都低于热研8-79，可见这些基因具有一定的品系特征。对这些基因在不同植株中表达量的变异系数进行分析，结果表明MYC1、HRT2基因表达量的株间一致性差，可能不适合作为产量育种早期选择的分子标记，在育种中只能起到辅助作用。发展分子标记是育种的方向，寻找产量密切相关并且株间一致性好的特异基因对于产量育种的早期筛选很有必要，这些工作都有待进一步的研究。

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