鸽源新城疫病毒的分离与鉴定

董孝乾 孔艳 高月花 王震 刘妮妮 史效茹 李园

摘 要：山西地区某商品信鸽养殖场的信鸽死亡淘汰率突然增加，这些病鸽主要表现为食欲下降、排白绿色稀粪，头颈斜仰扭转于颈后、呈现观星状，表现出一种典型神经症状。主要剖检症状为内脏器官不同程度的肿胀与出血，结合流行病学、临床症状、病例剖解变化，经实验室细菌分离、病毒分离以及RT-PCR检测，最终被确诊为鸽新城疫。

关键词：鸽；新城疫；细菌分离；病毒分离；RT-PCR

中图分类号：S858.39 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2014）11-0011-04

鸽新城疫是由副粘病毒科副粘病毒属禽I型副粘病毒[1]感染引起的一种高度接触性、急性败血性传染病[2]。该病发病急，传播迅速，死亡率高，是养鸽业的最大危害之一[3]。临床主要表现为体温升高、食欲下降，羽毛失去光泽；排白绿色稀粪；发病2～3d后出现典型的神经症状，头颈震颤，一侧或者两侧翅或腿麻痹，共济失调，头颈歪斜或头扭转置于背上呈特殊的观星状[4]，最终麻痹死亡。2013年8月山西某养殖场的信鸽出现神经系统、消化系统与呼吸系统混合感染症状的疾病，根据其临床症状疑为鸽新城疫。经实验室病原分离及RT-PCR方法检测证实为鸽新城疫，现将分离鉴定流程及结果作如下报告：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病鸽来源于山西地区某信鸽养殖场，病鸽为28～50日龄。养殖户采取家养方式饲养。

1.1.2 试验用鸡胚 10日龄SPF鸡胚，由山东无特定病原鸡实验种鸡场提供。

1.1.3 试验动物 10日龄SPF雏鸡，由山东无特定病原鸡实验种鸡场提供种蛋，公司SPF实验动物房孵化出雏，实验动物房负压隔离器内饲养至所需日龄。

1.1.4 1%鸡红细胞 取SPF公鸡血5ml，加入抗凝剂，生理盐水冲洗、1500rpm/min离心7min，反复操作3次，制备鸡红细胞悬液。

1.1.5 培养基及生化试剂 NDV标准强毒株F48E9及NDV阳性血清，均由山东省农业科学院家禽研究所禽病研究室保存。

禽流感（AIV H9）标准阳性血清，来自于农业部动物卫生检疫所。

AIV鸡减蛋综合征（EDS）标准阳性血清，购自于中国兽医微生物菌种保藏中心。

Taq酶、PCR Marker以及M-MLV反转录试剂盒等，购自大连宝生物工程有限公司。

细菌培养基及其他生化试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病鸽解剖观察 采用常规解剖方法对病鸽进行解剖，观察病鸽的组织器官病理变化，并无菌采集病料。

1.2.2 病料处理 对无菌采集病鸽肠道、气管、肝脏、肾脏以及脑组织进行如下处理：其中肠道、气管、肝脏、肾脏混合加入含有2000IU/ml[5]双抗的生理盐水进行研磨，脑组织单独进行研磨，获取研磨液。将研磨液反复冻融三次，8000rpm/min离心15min，过滤除菌，获取上清液。

1.2.3 无菌检测 取反复冻融后的上清液进行细菌分离，无菌接种血清平板，37℃培养，24～48h[4]观察是否有细菌生长。

1.2.4 病毒分离 取反复冻融后的上清液接种11日龄鸡胚，每枚鸡胚接种0.1ml，37℃孵化120h，24h内死胚弃去，收集24～120h死亡鸡胚尿囊液，测定尿囊液是否有血凝性，并观察鸡胚病理变化。将尿囊液进行适当稀释，进行盲传，测定其血凝效价，盲传至血凝价不再发生变化，按照Reed和Muench法计算ELD50[6]，并且计算10日龄鸡胚的平均死亡时间MDT[2]，即MDT=（Ah死亡鸡胚数×Ah+Bh死亡鸡胚数×Bh+……）/死亡鸡胚总数。

1.2.5 病毒鉴定

1.2.5.1 HA与HI试验 将无菌收获的尿囊液进行血凝（HA）试验，如果出现血凝，用鸡NDV、EDS、AIV H9标准阳性血清进行血凝（HI）抑制试验，观察试验结果。

1.2.5.2 RT-PCR 参照已发表鸽NDV序列，设计一对检测引物：正链引物为：5' -AGTGTAGCTCTTGGGGTTG-3'，负链引物为5'-ACTGCTGCATCTTCCCAAC-3'，扩增片段大小为184bp。另针对鸽NDV F基因，设计一对引物用于扩增F基因全序列：正链引物为5'-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3'，负链引物为5'-TTGTAGTGGCTCTCATC-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。鸡胚尿囊液及病料组织RNA提取按试剂盒说明进行。取DEPC水溶解后的RNA模板，加正链引物1μl，于70℃作用5min后，分别加入5×reaction buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor 1μl，10mmol/L dNTP 2μl，M-MLV反转录酶1μl，冰浴混匀，37℃ 60min，70min作用10min，反转录完成；取反转录产物为模板进行PCR，反应体系如下：RT产物5μl，正负链引物各1μl，10×PCR缓冲液2.5μl，10mmol/L dNTPs 1.25μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至总体积25μl，反应条件如下：94℃ 3min，然后94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，取5μl反应产物进行琼脂糖凝电泳鉴定。回收F基因扩增产物，进行克隆测序，利用MEGA软件进行遗传进化分析。

2 试验结果

2.1 临床症状 病鸽表现为精神萎顿，食欲下降，厌食，并出现明显的神经症状，表现为头颈斜仰扭转于颈后、头向后侧仰呈观星症状；眼睛病变主要表现为凹陷、部分病鸽眼睛出现炎症，具有脓性分泌物；病鸽出现明显的绿色粪便，肛门周围被绿色粪便污染。

2.2 病理剖检病变 气管内有粘性分泌物，气管环出血；喉头、肠道以及脑组织有不同程度的出血；肾脏肿胀明显，并出血；消化道、呼吸道有较多粘液回流，肌胃充满绿色内容物；脑组织水肿、充血，并伴有少量出血点；肝脏轻微肿大，边缘出现不同程度坏死；气囊浑浊，周围有白色干酪物附着。

2.3 无菌检测 24～48h，观察已接种血清平板，均无细菌生长。

2.4 病毒分离 死亡鸡胚尿囊液，初代最高血凝价为1：22，盲传五代之后血凝价达到1：28。生物学特性测定，对鸽子病料进行105、106、107倍稀释，测得 ELD50=106.5；第一代MDT=72.35h，第二代MDT=86.32h，第三代MDT=83h，第四代MDT=77h，第五代MDT=66.7h，第六代MDT=55.7h。

2.4.1 初代鸡胚病变 48h死亡鸡胚瘦小，胚体充血严重，并伴有不同程度出血，尤以颈部出血严重；92、102h死亡鸡胚全身水肿，出血严重，肝脏表现为严重的花斑样，肌胃出血严重，尿囊液浑浊且粘稠。

2.4.2 盲传鸡胚病变 死亡鸡胚尿囊液粘稠，全身水肿，出血严重，肾脏肿大出血，全部胚体肝脏出现明显的花斑样，腹腔内充满乳白色液体，肌胃与脾脏出血严重；盲传第4代鸡胚尿囊液清亮，其余病变与前几代相比没有明显变化；盲传第6代胚体整体表现瘦小，出血与水肿现象有一定程度的减轻，花斑肝现象明显减轻，只有个别胚体出现，其他病变无明显变化。

2.5 病毒鉴定

2.5.1 HA与HI试验 鸡胚尿囊液出现明显的血凝现象，这种血凝现象能够被NDV标准阳性血清抑制，而不被EDS、AIV H9标准阳性血清所抑制，这说明分离到的病原为新城疫病毒，并将该毒株命名为APMV-1/Pigeon/China/SX13/2013（简称SX13）。

2.5.2 RT-PCR 病料上清和鸡胚尿囊液PCR产物电泳后均出现184bp条带，说明新城疫核酸检测均为阳性，见图1。该毒株F基因ORF全长为1662bp，裂解位点氨基酸序列为112RRQKRF117，在114位Q的两侧为2对碱性氨基酸，第117位为F，符合强毒裂解位点序列特征[7]。利用MEGA软件对其进行遗传进化分析表明，该病毒属基因VI型，见图2。

3 分析讨论

3.1 病鸽临床症状和病理剖检病变均与鸡新城疫症状有很多相似之处，尤以神经系统与呼吸消化系统变化最为相似，根据以上症状初步诊断为新城疫病毒感染。通过对病鸽的实验室细菌分离、病毒分离以及RT-PCR检测，最终确诊为鸽新城疫。

3.2 本次实验，用最初的病料作盲传，血凝价并不高，盲传到第三代血凝价仅为1：24；第六代时，血凝价较高，达到1：28，血凝价趋于稳定，这提示我们在从事病原的分离与鉴定时，第一代没有出现血凝价时，要多盲传几代，以免因分离不彻底而影响结果判断，造成不必要的损失[8]。通过MDT数值可知，MDT的数值从第二代至第六代逐渐变小，这说明该病原在一定盲传代数内，每盲传一代，10日龄鸡胚的平均死亡时间呈现总体缩短的趋势，病毒致病力有所增强；从MDT数值上分析，结合ELD50=106.5确定该致病原为新城疫中强毒株。

3.3 新城疫是商品鸽所有疫病中发生频率最高、危害最大的一类传染病，约占临床病例的20%～30%。该病在上世纪80年代初开始在我国流行，并逐年增多，现已广泛流行于我国各地区。该病的发生没有明显的季节性，不同品种、日龄的鸽均可感染此病，但幼鸽更易感。该病的传播途径是消化道和呼吸道，是一种接触性传播疾病，自然感染的鸽群发病率和死亡率变化较大，一般在20%～90%，幼鸽可达100%[5]。

传统的检测方法需经病毒分离后，再通过血清学试验判断是否为NDV感染，耗时耗力。本文中同时采用了病毒分离、血清学实验以及RT-PCR两种方法进行诊断，前者需经至少60h才能得出结果，而RT-PCR方法在8h之内即可判断核酸检测是否为阳性，就可以确定是否为新城疫感染，这大大节约了诊断时间，更加有利于该病的诊断与防控。

从病毒基因型上讲，鸽源NDV绝大多数为基因Ⅵ型，而鸡源强毒NDV一般为Ⅶ型，二者致病性有所不同，抗原性之间也有一定差异，但目前市场上仍无鸽专用的新城疫疫苗，一旦发生该病，可用鸡新城疫La Sota、Clone30等弱毒疫苗紧急接种。通常情况下，建议一周日龄左右雏鸽进行一次新城疫弱毒疫苗免疫，青年鸽在1月龄左右进行一次灭活疫苗免疫，种鸽留种前根据抗体水平适当进行1～2次灭活疫苗免疫，基本可以对本病起到较好的防控作用。

参考文献：

[1] 孙兰英，杜守信，于国杰.肉鸽新城疫的诊治报告[J].农技服务，2009，26（9）：68-69.

[2] 刘振湘.湖南省鸽新城疫病毒的分离与鉴定[J].中国动物检疫，2002，19（10）：22-24.

[3] 符子华，张波，易忠.等.鸽新城疫病原的分离与鉴定[J].新疆农业科学，2004，41（专刊）：32-34.

[4] 陈轶霞，韩庆彦，杨小玲.鸽新城疫的病原分离与鉴定[J].中国兽医科技，2001，31（2）：31-32.

[5] 李霞，亓丽红，于可响.等.肉鸽新城疫强毒的分离与鉴定[J].家禽科学，2008（9）：37-38.

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[7] 刘华雷，王永坤，严维巍，等.中国部分地区新城疫病毒的分子流行病学研究[J].扬州大学学报（自然科学版）.2001，1（4）：35-40.

[8] 熊永忠，王秀荣，曹殿军，等.鸽源新城疫病毒的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2002，5：22.