冷冻对哺乳动物胚胎发育分子调控的影响

宁效斌　苏雷

摘要 综述了几种与哺乳动物胚胎发育分子调控相关的重要蛋白质以及超低温冷冻保存在分子水平上对胚胎发育的影响。

关键词 哺乳动物；冷冻；胚胎发育；分子调控

中图分类号 S813.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03926-04

Abstract Several essential kinds of proteins related to the molecular regulation of mammalian embryonic development were reviewed， as well as effects of cryopreservation on embryonic development at the molecular level.

Key words Mammalian； Cryopreservation； Embryonic development； Molecular regulation

近年来，由于胚胎冷冻技术的不断进步，已成为一项成熟的胚胎工程技术，甚至克隆胚胎通过冷冻技术也获得了相应的后代[1]。尽管如此，胚胎冷冻的机理尚不十分清楚。除了冷冻保护剂的毒性、冷冻损伤、细胞内冰晶的形成等因素对胚胎产生影响外，冷冻本身可使胚胎内的一些固有结构、物质（如mRNA）发生改变[2]，严重影响胚胎的存活率。冷冻/解冻后胚胎的基因表达分析可能是一种有效揭示这类胚胎早期发育分子机制的有效途径。

1 哺乳动物胚胎发育过程中相关的重要蛋白质

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，细胞内物质的变化错综复杂。早期胚胎的发育是由卵母细胞中的一些因子来调控的，这些因子是在卵母细胞发育过程中合成和存储的。在胚胎基因组活性激活以前，胚胎的发育是由这些因子来调节的。胚胎形成后，基因组的转录和表达才被启动，胚胎的发育逐渐由自身合成的物质来调控。

1.1 DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）

目前，在哺乳动物中已发现4种DNA甲基转移酶（Dnmts），根据结构和功能的差异分为两大类：分别以Dnmt1和Dnmt3为代表。前者主要用于保持子代细胞与母细胞相同的DNA特异性甲基化模式，参与甲基化状态的维持，也是非CpG位点从头甲基化所必需的，并与甲基化状态的延伸有关；后者包括Dnmt3a、Dnmt3b以及Dnmt3L等，主要负责建立胚胎发育分化过程中的组织特异性甲基化模式，是主要的从头甲基化酶[3]。Dnmt对早期胚胎的正常发育至关重要[4-5]。

在不同的序列类别中，哺乳动物的DNA甲基化对基因的转录活性是一种主要和关键的表观遗传调节机制（Epigenetic regulatory mechanism）。在小鼠的生殖细胞发育过程中，从头甲基化只在非常有限的时期发生，说明Dnmt3a和Dnmt3b在限制功能的表达有一定的机制作用[6]。分析Dnmt3a还能确定表观遗传重编程（Epigenetic reprogramming）的潜能差异[7]。Dnmtl蛋白在胚胎发育时建立组织特异性甲基化模式方面发挥重要作用，在正常发育的胚胎中维持一种正确的DNA甲基化模式需要Dnmt1地正确表达和发育阶段特定的翻译后调节[8]。在绵羊的生发泡（Germinal vesicle，GV）期卵母细胞及早期胚胎发育过程中，GV期卵中Dnmt1 mRNA含量最高，从2-细胞胚胎开始直至囊胚，Dnmt1基因的mRNA含量显著降低，Dnmt1的含量在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中存在动态变化，这对卵子生长和胚胎发育具有重要意义[9]。

1.2 缝隙连接蛋白（Connexins）

此类蛋白是细胞间建立缝隙连接所必需的。在研究胚胎致密化的分子调控时发现，牛体内胚胎在桑椹胚期可检测到connexin43（Cx43）的表达[10]，体外生产的牛胚胎有的不表达这类蛋白，导致胚胎不能致密化，无法形成桑椹胚[11]，从而降低胚胎潜能性。在绵羊卵母细胞和早期胚胎发育过程中，connexin26、connexin32、Connexin43及Connexin45在各个时期均有表达，Cx43在未成熟卵母细胞、体外成熟（IVM）卵母细胞、2-细胞中表达量较低，桑堪胚和囊胚期时达到最高；而Cx45在8-细胞期表达量最高，未成熟卵母细胞、IVM卵母细胞和2-细胞期的表达量低于8-细胞期，桑堪胚和囊胚期胚胎的表达量稍低于8-细胞期；Cx43和Cx45蛋白在体内受精胚胎中转录子的含量高于体外受精（IVF）胚胎[12]。Cx43基因在水牛IVM卵母细胞中表达量最高，显著高于IVF 2-细胞期胚胎、桑椹期胚胎、囊胚期胚胎[13]。

1.3 上皮钙调素蛋白（Epithelial cadherin，E-cadherin）

调节上皮细胞间粘连的重要蛋白，其功能的发挥需要Ca2+的参与。在研究胚胎致密化及细胞间连接的分子调控时发现，E-cadherin是桑椹胚外层细胞或囊胚滋养层细胞间紧密连接复合体形成的主导因子，胚胎致密化或囊胚的形成主要依赖于此蛋白。如果这种蛋白质缺失或其功能达不到正常发挥，胚胎在桑椹胚或囊胚期的发育就会出现异常[14]，导致胚胎不能进入下一发育阶段。在水牛IVM卵母细胞及IVF早期胚胎发育过程中，E-cad基因在各个时期中mRNA表达无显著差异[13]。

1.4 紧密连接蛋白（Tight junction protein）

研究表明外层细胞间的紧密连接至少是由5种蛋白构成的复合体，它们分别是ZO-1、ZO-2、7H6、扣带蛋白和封闭蛋白。封闭蛋白是核心成员之一，它与ZO-1和扣带蛋白结合在一起构成细胞外连接和细胞内骨架间的结合链，使胚胎内细胞之间紧密连接起来。ZO-1是构成细胞间连接的主要成分，在小鼠和牛胚胎外层细胞的连接部位，呈点状分布[14]。外层细胞的紧密连接在胚胎发育过程中具有重要功能：调节相邻细胞间的物质运输；维持外层细胞的极性；维持Na/K-ATP酶的极性分布；维持半透膜的稳定性，防止过度膨胀[15]。

1.5 干扰素-τ（Interferonτ，IFN-τ）

IFN-τ是一种孕体分泌蛋白，在反刍动物的整个妊娠失败中早期胚胎死亡占有很大的比例，它在很大程度上是由母体妊娠识别失败造成的。IFN-τ是由反刍动物孕体附植时发出的特有的妊娠识别信号，是建立母体妊娠识别的一种主要因子。另外，IFN-τ在免疫方面也起着重要作用。

牛胚胎在体外生长发育过程中，IFN-τ在胚胎发育的各个时期均有表达，除在未成熟卵母细胞中呈高表达外，其余都呈低表达，这与其维持黄体功能密切相关[16]。Rho G J等也研究表明IFN-τ在胚胎发育的各个时期均有表达[17]。然而，也有研究表明IFN-τ mRNA在牛IVF第4天的16-细胞胚胎期、体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）第5天的桑椹期、孤雌激活（Parthenogenetic activation，PA）第6天的早期囊胚期首次表达[18]。

1.6 热休克蛋白（Heat shock proteins）

哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温时，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为5类，分别为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 以及小分子热休克蛋白（Small heat shock proteins，sHSPs）。

在牛胚胎体外生长发育过程中，Hsp70在胚胎发育的各个时期均有表达，但表达量稍低[16]。1999年C.WRENZYCKI等在对牛体外胚胎进行培养时，发现添加血清的培养液获得的早期胚胎比添加聚乙烯醇（PVA）的培养液获得的早期胚胎的潜能性更高，差异显著，同时，在2个试验组中均发现Hsp70持续表达，且添加血清的比添加PVA的试验组显著增加[19]，表明Hsp70的表达量与体外生产的胚胎质量成正相关。Mishra A等研究也发现Hsp70在胚胎发育的各个时期均有表达，但在发育缓慢的胚胎中Hsp70的表达量较少，8-16细胞期后几乎不表达；它与温度紧密相关，随着温度的增加，Hsp70 mRNA的表达量也相应提高，说明Hsp70 mRNA的表达可能作为胚胎对温度敏感性的靶标[20]。

1.7 葡萄糖转运蛋白（Glucose transporters）

此类蛋白与细胞代谢有关。2002年Knijn等研究表明牛体内受精获得的囊胚期胚胎

Glut-1表达量显著高于体外获得的囊胚期胚胎[21]。在牛胚胎体外生长发育过程中，Glut-1基因一直持续高表达，这与体外培养的胚胎生长发育状况密切相关[16]。

Rajhans R等研究也发现Glut-1在水牛体外生产胚胎发育的各个时期均有表达，但在发育缓慢的胚胎中Glut-1的表达量较少，8-16细胞期后几乎不表达，说明Glut-1的表达与胚胎发育阻滞密切相关[22]。2010年J. Zaraza等研究表明Glut-3在8-细胞、16-细胞时期表达水平低，囊胚期表达量增加，说明葡萄糖转运蛋白对囊胚期胚胎是非常必需的[23]。哺乳动物附植前胚胎能轻易地吸收及利用葡萄糖，葡萄糖转运蛋白发挥了很大作用。另外，有研究发现Glut1、Glut3、Glut8在胚胎发育早期各个时期均有表达，而Glut2仅在囊胚期开始表达[24]。

1.8 细胞凋亡相关蛋白

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列蛋白调控的细胞主动死亡过程。其中，bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡。

研究发现高浓度葡萄糖可诱导小鼠囊胚细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达，其表达在内细胞群尤其明显，并伴有囊胚细胞数目明显减少，从而证实高浓度葡萄糖对胚胎的毒性作用在胚胎着床前已经发生[25]。Bcl-2基因通过阻止抑制细胞凋亡直接调控正常免疫器官的发育， 在淋巴细胞发育过程中Bcl-2是免疫细胞亚型选择的重要调节物[26]。在小鼠体内早期胚胎发育过程中，随着胚胎细胞数目的增加，凋亡比率逐渐增大；Bax表达量在整个过程中基本不变，Bcl-2表达量逐渐上调，Bak、Bcl-xl的表达量逐渐降低[27]。2008年H.Y.Jang等用牛输卵管上皮细胞（BOEC）与胚胎共培养时，发现不管是共培养获得的早期胚胎还是单独培养得到的早期胚胎，均检测到Caspase-3和Bax基因，然而p53基因只在与BOEC共培养的胚胎中被检测到[28]。2006年Boon Chin Heng等研究表明细胞凋亡而不是细胞坏死是降低冷冻/解冻后的人类胚胎干细胞（hES）生存能力的主要机制，此hES是用传统冷冻法冷冻保存的[29]。

2 超低温冷冻对胚胎的分子调控研究现状

2007年Dhali等采用微滴玻璃化冷冻法（Droplet vitrification）冷冻小鼠囊胚期胚胎时，发现冷冻后的胚胎与鲜胚相比，Bax、Bcl-2和p53 3个基因转录物相对量均下降，同时冻胚的发育潜能力比鲜胚低，表明此3种基因转录物与胚胎发育潜力有很大的联系[30]。然而，2010年Kuzmany等研究牛胚胎的冷冻时发现，与冷冻前的胚胎相比，冷冻后胚胎中的Bax及Bcl-XL转录物相对量均显著增加，说明超低温冷冻对胚胎内细胞凋亡的相关基因转录物同样有影响[31]。2011年Anna Kuzmany等也发现，与体外培养获得的牛鲜胚相比，冷冻后囊胚中的Bax、Bcl-XL基因表达显著上调（Up-regulation），结果表明冷冻后的胚胎已经开启mRNA合成，为下一步胚胎发育做准备[32]。2012年Lisa Shaw等研究超低温冷冻对人早期胚胎的基因表达时发现，与鲜胚相比，冷冻组的4-细胞胚胎与囊胚Bax表达显著上调[33]。

2006年Sae Young Park等用2种不同玻璃化冷冻法（0.25 ml麦管开放式拉管法和最小容积法）对牛囊胚进行冷冻试验，发现survivin、Fas、caspase-3及Hsp70的表达水平较非冷冻组显著增加，表明冷冻程序可能导致胚胎损伤，从而引起DNA破裂且细胞凋亡相关基因转录物也随之增加，最终降低了冷冻胚胎的发育潜能[34]。2010年Kuzmany等研究也表明，与冷冻前相比，冷冻后扩张囊胚（Reexpanded blastocysts）中的HSPA1A mRNA显著增加[31]；与牛IVP正常胚胎相比，玻璃化法和传统冷冻法使孵化囊胚中的HSP70转录物的相对量受到明显影响，揭示不同冷冻方法对牛孵化囊胚中的重要基因表达量具有很大影响[35]。 2011年Stinshoff等用传统冷冻法与玻璃化冷冻法对牛扩张囊胚期胚胎进行冷冻保存时，发现用玻璃化法的HSPA1A与鲜胚组存在显著差异，用传统冷冻法的HSPA1A与鲜胚组相比也存在显著差异，而玻璃化法（Vitrification）比传统冷冻法（Conventional slow freezing）更适合于保存胚胎[36]。2011年Anna Kuzmany等研究时发现，与体外培养获得的牛囊胚期鲜胚相比，冷冻后的囊胚中Hsp 1A的转录物显著地上调[32]。

与 IVP 的正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和传统冷冻法冷冻后的孵化囊胚中GLUT-1转录物的相对量受到明显影响，用传统冷冻法冷冻后的孵化囊胚中的GLUT-3 mRNA量也受到显著影响，结果表明冷冻处理过程本身及冷冻方法对牛孵化囊胚中的重要基因的表达有很大影响[35]。2011年Stinshoff等发现用玻璃化法冷冻后的扩张囊胚中Glut-1表达丰度与鲜胚存在显著差异，用传统冷冻法冷冻后的Glut-1、 Glut-3与鲜胚组也存在显著差异，揭示玻璃化法比传统冷冻法更适合于保存胚胎[36]。

在研究胚胎致密化及细胞间连接的分子调控时发现，与 IVP 正常牛孵化囊胚相比，用玻璃化法和传统冷冻法冷冻后的孵化囊胚中ZO-1转录物的相对量明显受到影响，同时发育潜能也降低[35]。与正常鲜胚相比，传统冷冻法冷冻后的孵化囊胚中DNMT3a mRNA量受到显著影响[35]。2011年Stinshoff等发现用传统冷冻法冷冻后的胚胎中DNMT3a mRNA相对丰度与鲜胚组相比也存在显著差异[36]。对干扰素的研究发现传统冷冻法冷冻后的牛孵化囊胚中的IFN-τ mRNA量受到显著影响[35]。2011年Stinshoff等也发现用传统冷冻法冷冻后的牛胚胎IFN-τ mRNA量与鲜胚对照组存在显著差异，此外玻璃化法与传统冷冻法相比IFNT2基因转录物也存在显著差异[36]。

3 小结

综上所述，超低温冷冻保存对哺乳动物体外生产胚胎质量的影响在分子水平上清楚地得到反映。在胚胎冷冻过程中，研究表明尽可能保证及维持早期胚胎基因组的正常表达，冻融胚胎的潜能性就可以得到提高，从而可以依此判断冷冻方法的可行性及高效性。从分子水平上来分析胚胎的质量，可为拯救濒危动物和开发利用珍稀动物及解决基因克隆的低效率问题提供技术参考。随着分子检测技术的不断提高，胚胎质量的鉴定也会更加方便准确，胚胎冷冻损伤机制也将得到进一步阐释。

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