绣球菌多糖的提取及对果蝇寿命的影响

赵志强等

摘要 [目的]研究绣球菌多糖对果蝇寿命的影响。[方法]采用热水浸提法从绣球菌中提取多糖，并采用三氯乙酸法对多糖进行纯化，并研究绣球菌多糖对果蝇寿命的影响，为绣球菌的开发利用提供试验依据。[结果]热水浸提法提取的粗糖含量与得率分别为47.6%和15.26%；三氯乙酸法纯化后的多糖含量与得率分别为58.3%和7.7%。在0.2～5.0 g/L时，绣球菌多糖能延长果蝇的寿命和半数死亡时间。当绣球菌水溶粗多糖在0.2 g/L时，雄果蝇平均寿命延长26.6%，半数死亡时间为（46.4±2.6）d，最高寿命为（55.7±1.8）d，雄果蝇的寿命延长率最大。[结论]绣球菌多糖对果蝇的寿命有延长作用，对雄性的抗衰老效果好于雌性。

关键词 绣球菌；多糖；果蝇；抗衰老

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03863-02

Abstract [Objective] To study the effect of Sparassis crispa polysaccharide on the lifespan of Drosophila melanogaster and provide the experimental basis for the development and utilization of sparasis crispa. [Methods] The hot water extraction was used to extract polysaccharide and trichloroacetic acid method was used to purify polysaccharide. [Results] The hot water extraction was used to obtain coarse polysaccharide， its sugar content and yield were 47.6% and 15.26%； the content of polysaccharide purified and yield were 58.3% and 7.7% respectively. At 0.2-5 g/L， Sparassis crispa polysaccharide can prolong the life of Drosophila and half of the time of death. When the water soluble crude polysaccharide of Sparassis crispa is 0.2 g/L， the male Drosophila melanogaster can extend the average lifespan of 26.6%， median survival time was 46.4 ± 2.6 days， and 55.7 ± 1.8 days for maximum lifespan， showing the highest extension rate of male Drosophila melanogaster. [Conclusion] Sparassis crispa polysaccharide can extend lifespan of Drosophila melanogaster， and the effect on male Drosophila melanogaster is better than on female one.

Key words Sparassis crispa； Polysaccharide； Drosophila melanogaster； Antiaging

绣球菌（Sparassis crispa Fr.）属无隔担子菌亚纲无褶菌目绣球菌科绣球菌属，是一种非常珍稀名贵的食药用菌[1]。多糖是绣球菌重要的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖和降血脂等药理活性[2-4]。目前，对于绣球菌多糖抗衰老活性的研究鲜有报道。笔者采用水煮醇沉法提取绣球菌多糖[5-7]，并研究其对果蝇的抗衰老活性，以期为绣球菌资源的开发利用提供可靠数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。绣球菌，购自浙江磐安山村侬农特产有限公司，粉碎，过40目筛，备用。

1.1.2

主要仪器。PDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；752N紫外可见分光光度计，购自上海科学精密仪器厂；HHS型电热恒温水浴锅，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BS 124S电子天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；PHS-25型数显酸度计，购自上海天达仪器有限公司；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；Galanz WD800G微波炉，购自佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；HPP-9162恒温培养箱，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司。

1.1.3

主要试剂。95%乙醇、无水乙醇、乙醚、葡萄糖、三氯乙酸、浓硫酸、苯酚、琼脂、蔗糖、玉米粉、丙酸和酵母粉的奶粉所有试剂均为分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

粗多糖提取。绣球菌子实体粉末→加水溶胀过夜→水浴提取2次、2 h/次→离心→合并上清→浓缩→3倍体积乙醇醇沉过夜→离心→沉淀加无水乙醇、乙醚洗涤→离心→沉淀常规干燥→即得水溶粗多糖。

1.2.2

粗多糖纯化。精确称量水溶粗多糖，用蒸馏水配制成5%糖液。加入浓度10%三氯乙酸调节其pH值至3，静置过夜，离心（3 000 r/min，10 min）上清中加入4倍体积的浓度95%乙醇再静置过夜，离心，沉淀加入无水乙醇、乙醚洗涤，真空干燥器中干燥，即得水溶、碱溶和酸溶去蛋白多糖。

1.2.3

多糖含量测定。（1）葡萄糖标准曲线的制定见参考文献[8]。（2）多糖含量的测定。采用苯酚-硫酸法。精确称量水溶多糖5 mg，分别定容至50 ml容量瓶中备用。各取1 ml于相应的试管中，采用苯酚-硫酸法，在490 nm波长处测定吸光度，用回归方程计算出样品中多糖含量和得率，多糖得率（%）=粗多糖含量/原料重量×100。

1.2.4

多糖活性的研究。（1）果蝇培养基的配置[9]。先将琼脂加热溶解，再溶入蔗糖，然后慢慢加入玉米粉，边加边搅拌，成为糊状后停火，待温度稍微下降后，加入丙酸，充分搅拌后立即分装于洁净的培养瓶中，待培养瓶瓶壁晾干后在培养基表面撒一层酵母待用，培养温度为25 ℃。将提取到的粗多糖和纯多糖分别以不同的浓度置入基本培养基中，代替蔗糖，其他方法同上，每个批次重复3次。（2）绣球菌多糖对果蝇寿命的影响。将成熟果蝇装入有基础培养基的50 ml三角瓶内交配产卵，形成蛹时除去亲本蝇，收取10 h内羽化的果蝇，用乙醚将其麻醉后，分出雌雄，挑取体型大小相近的果蝇进行分组。将选取好的雌雄果蝇平均置入基本培养瓶和含有不同浓度绣球菌多糖的培养瓶中，每个培养瓶放入15只果蝇，雌雄分瓶培养。多糖组的果蝇在基础培养基中培养到第14天后，转到含不同浓度多糖提取物的培养基中培养直至其全部死亡。试验在温度（25±1） ℃、相对湿度50%～70%的培养箱内进行，每隔4 d 更换新鲜的培养基。每天定时统计果蝇死亡数直至果蝇全部死亡。试验结束后计算每组的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命。数据用SPSS软件统计，采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 绣球菌多糖含量与得率的测定

精确称取10.00 g绣球菌粉末，采用热水浸提法提取绣球菌多糖。通过三氯乙酸法脱蛋白后，得去蛋白水溶多糖。根据苯酚-硫酸法，得葡萄糖回归方程为：Y=0.009 4X+0.019 （R2=0.997 5）。由表1可知，绣球菌水溶多糖含量随着三氯乙酸法脱蛋白后有所增加，而多糖得率却减少。

3 结论

不同浓度的绣球菌水溶粗多糖与去蛋白多糖对果蝇的寿命均有延长作用，绣球菌多糖对雄果蝇寿命延长的效果高于雌性，这可能与动物的寿命存在差异有关[10]。试验结果发现，绣球菌多糖浓度为0.2 g/L的情况下对果蝇寿命延长效果最佳，水溶粗多糖对雄性果蝇的半数死亡率延长效果最好，去蛋白水溶多糖对雌性果蝇的半数死亡率延长效果最好；并且随着多糖浓度的增加，延长果蝇寿命的效果呈下降趋势。因此，绣球菌多糖对果蝇具有抗衰老的作用，为开发利用绣球菌多糖提供了试验依据。

参考文献

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[2] 朱斗锡，何荣华.珍稀名贵绣球菌的经济价值及开发前景[J].食用菌，2008（3）：8.

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[7] 张一帆，张智，魏志艳，等.四种方法提取灵芝粗多糖的得率比较试验[J].食用菌，2010（6）：58-60.

[8] 毛慧玲，束盈慧，叶子坚，等.茶树菇多糖提取方法[J].南昌大学学报：理科版，2006，30（1）：49-51.

[9] 王贵民，董振红，郝再彬.甜叶菊糖苷对果蝇生长和繁殖的影响[J].昆虫知识，2009，46（1）：129-132.

[10] 兰瑛，潘志福，张松，等.尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对果蝇寿命的影响[J].中国食菌，2010，29（4）：43-45.