虎雪兰与朱砂兰、蕙兰正反交育种及种子无菌萌发与增殖研究

李慧敏等

摘要 [目的]研究虎雪兰与朱砂兰、蕙兰正反交育种及种子无菌萌发与增殖。[方法]以虎雪兰、朱砂兰、蕙兰‘绿春兰为亲本，采用正反交杂交法进行育种试验得到果实，对成熟的种子进行无菌萌发试验，并对种子萌发获得的小苗进行增殖研究。[结果]朱砂兰为母本获得杂交种子无菌萌发最适培养基为：1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3%花宝1号+0.05%碳粉；最佳增殖及生长培养基为：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花宝4号+0.05%碳粉。蕙兰‘绿春兰为母本获得种子萌发最适培养基为：1/2MS+1.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+3%花宝1号+0.05%碳粉；最佳增殖及生长培养基为1/2MS+1.5 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%花宝4号+0.05%碳粉。[结论]该方法为虎雪兰的种质资源栽培提供了理论依据。

关键词 虎雪兰；种间杂交；无菌萌发；增殖；不亲和性

中图分类号 S682.31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）13-03812-03

Abstract [Objective] This paper aims to study the aseptic budding and fast propagation on Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii interspecific hybridization seed. [Method] Cymbidium tracyanum var huanghua， Cymbidium mastersii and Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan were employed as parents. The hybrid seeds were tested using direct crossing and reciprocal crossing， then germinated and compared with different medium in axenic culture. [Result] The results show that the best medium for the seeds of Cymbidium mastersii in axenic culture is 1/2MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3% Hyponex 4+0.05%C. The medium for the seeds of Cymbidium faberi Rolfe ‘Lv Chun Lan in axenic culture is 1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3% Hyponex 1+0.05%C， the best medium for multiplication culture and differentiation is 1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT+3%Hyponex+0.05%C. [Conclusion] This method provides a theoretical basis for the germplasm resource cultivation of Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii.

Key words Cymbidium tracyanum var huanghua×Cymbidium mastersii； Interspecific hybridization； Aseptic germination； Propagation； Incompatibility

广义的兰花是指兰科（Orchidaceae）植物，但中国人传统上所称的兰花常常是指具有较高观赏价值的兰属植物。随着我国人民生活水平的不断提高和消费观念的逐步转变，追求高雅健康的兰文化已经成为一种时尚和潮流。只有新品种、高质量兰花的推出才能进一步促进兰花市场的发展。然而兰花远缘杂交育种因遗传差异显著而难度较高，杂交成功后的F1代变异性也较大。兰花生长缓慢，育种周期较长，技术难点多，必须长期坚持才能取得成效。不少科技工作者对兰花育种、种子萌发进行过研究[1-4]。兰花种子萌发是杂交育种的一个技术难点，而在组织培养条件下的无菌萌发是主要的途径之一。试验利用人工杂交育种方式和组织培养技术，对虎雪兰与朱砂兰、蕙兰杂交种子进行无菌萌发和生长分化研究，以期为探索兰花人工杂交育种技术，培育具有一定特色的新品种，同时为兰花种子无菌萌发及生长提供一定的理论参考，也为以后利用化学、物理诱变甚至基因工程创立新种质提供一定的技术方法和物质基础；而且，对保护和利用优异兰花种质资源，变资源优势为经济优势和促进云南省兰花走向世界都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。供试材料均由云南农业大学花卉研究所提供，为沉香虎头兰黄色素花与大雪兰杂交的新品种“虎雪兰”和朱砂兰、蕙兰“绿春兰”。

1.2 方法

1.2.1 虎雪兰与朱砂兰、蕙兰‘绿春兰正反交。试验地点为云南农业大学花卉研究所，于2011年11月在云南农业大学花卉所温室内展开。挑选生长健壮、无病虫害的亲本植株，采用正反杂交方法。选择在晴天，花朵开放2 d后的下午3：00进行授粉。授粉前先去除花粉块顶端的药帽，去除过程需谨防花粉块掉落，把花粉块用镊子轻轻取下放入干燥的烧杯中备用；然后将父本的花粉块置于母本的蕊腔中，再把母本上取下的花粉块置于父本的蕊腔中。授粉完成后，清晰标注杂交组合名称、杂交时间，授粉花朵数等。授粉之后对植株加强水肥管理并观察果实发育情况并记录结实率。

1.2.2 蒴果消毒。果实由深绿色转变成淡黄绿色时，挑选尚未开裂的饱满蒴果进行无菌播种试验。首先对兰花蒴果进行表面消毒，先采用10%～15%的次氯酸钠水溶液浸泡10～15 min后用无菌水冲洗2～3次，再采用浓度0.1%升汞（HgCl2）浸泡5～10 min后，用无菌水冲洗4～5次。

1.2.3 无菌萌发诱导。培养基使用MS、1/2MS培养基，加入按实验所需的不同浓度梯度和不同激素的配方以制作萌发诱导培养基。之后于无菌操作环境下，将蒴果横置于彻底消毒过的培养皿内，按“+”方式切开消毒后的蒴果，用镊子将其移动至培养基上方，使切口朝向培养基，并用镊子轻轻敲打蒴果的外壳，将种子均匀分散并充分接触于萌发诱导培养基表面以提高种子的成活率。最后将接种完成的培养基放在无菌培养室中进行光培养，环境温度保持在24～26 ℃，最适光照2 000 lx。按时观察试验，记录试验数据和现象。筛选出最适合杂交种子萌发的培养基和激素条件。

1.2.4 无菌体系建立。将种子萌发后形成的原球茎转移到不同激素浓度梯度配方下的继代培养基上，记录试验数据和现象；筛选出最适合原球茎增殖的激素条件，建立快繁体系。培养条件与种子无菌萌发诱导相同。

2 结果与分析

2.1 正反交结果与分析 对3种兰花杂交后生长和发育进行观测，发现授粉4 d后，蕊柱的顶端开始膨大并开始下卷，分泌透明粘液，7～8 d后子房开始膨大，花瓣开始萎蔫，花朵开始收缩。一个星期后子房开始膨大。在试验中发现，以虎雪兰为母本的杂交组合，子房膨大14 d后开始变黄，尔后整个脱落。由表1可知，以朱砂兰、蕙兰‘绿春兰为母本，均获得杂交果实，结实率为20.0%和37.5%。结实率较低，而以虎雪兰为母本与朱砂兰、蕙兰‘春绿兰进行杂交均未获得杂交果实。

3 讨论

3.1 种间杂交不亲和性 远缘杂交是种质创新的有效途径之一，但杂交的不亲和性及杂种的不育性是远缘杂交育种遇到的2大障碍[5]。另外种间杂交成功与否还与花粉管是否能够顺利到达胚囊，释放精子，雌雄配子体能否顺利结合以及受精后胚和胚乳是否能够协调一致的生长等一系列因素有关。研究表明，雌雄配子体结合后胚与胚乳生长不协调，胚囊已经解体或者胚乳供给营养不足等原因也会使雌蕊脱落[6]。试验中以虎雪兰为母本的杂交组合，与果荚膨大至一定大小后出现果柄枯黄脱落现象，与张志胜等对墨兰和大花蕙兰种间杂交表现一致[4]，表现为受精后杂种不育障碍。以朱砂兰、蕙兰‘绿春兰为母本结实率相对低，种子萌发过程中时间较长而且萌发率低。经过分析得出主要原因是由杂交亲和力较弱引起：朱砂兰、蕙兰‘绿春兰都属于国兰，与虎雪兰亲缘关系较远。

3.2 种子无菌萌发方法可行性较高 兰花种子非常细小、呈粉状，没有胚乳，胚内含有很少的营养物质，因此在自然条件下萌发率都很低。为了满足药用及花卉的需要，提高萌发率，各国学者在兰科植物种子无菌萌发方面进行了大量研究。由于无菌播种克服了微生物的干扰，为种子萌发补充了必要的营养条件，使兰花种子发芽率大大提高。试验借鉴前人经验以及已有技术对虎雪兰杂交种子的萌发进行了研究，为杂交种子选出最佳组培配方，为今后建立兰花繁育体系打下良好的基础[1，4，7]。

3.3 培养基、激素配比需要与不同的兰花材料以及生长时期相对应 基本培养基是植物组织培养的重要基质，由于每种植物的遗传特性、生物学和生态学特性不同，所需的营养成分也不尽相同，对培养基的成分要求也存在差异[8-9]，要实现兰花的快速繁殖，首先就必须对培养基进行筛选，在不同阶段，选择适当激素浓度。一般认为中低浓度无机盐（1/2MS）比较适合兰花种子的萌发[10]。在试验中，杂交种子在培养基MS、1/2MS上培养下均能萌发，但是萌发率却相差较大，在1/2MS培养基下萌发率较高、萌发时间相对较短，说明低盐培养基较适合试验杂交种子的萌发，支持了此结论。

3.4 添加物和褐化问题的相关性 在培养基中添加适量的天然提取物有利于兰花种子的萌发和生长，研究在培养基中添加了8%的香蕉泥，但加入香蕉泥之后，由于添加物内部激素的影响，促使植株活力降低，吸收能力减弱，导致叶色偏黄，苗体较弱，起不到很好的复壮作用，因此并不是所有的兰花都适合此法。试验加入香蕉泥之后出现轻微褐化现象，转而考虑使用一类具有吸附功能的添加剂活性炭。据报道，0.1%～0.5%活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显[11]。试验中加入了0.05%碳粉，可以有效抑制褐化现象的出现。

试验以朱砂兰、蕙兰‘绿春兰为母本，虎雪兰为父本，成功得到果实。对成熟的种子进行无菌萌发试验，并对种子萌发获得的小苗进行增殖研究。结果表明，低盐的1/2MS培养基，利用花宝和碳粉，加入适当浓度的BA、NAA和KT对兰花种子萌发及种子萌发后得到的兰花组培苗增殖有促进作用。

参考文献

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