脂肪组织工程的研究进展

刘亚南　郭杰　张炜

随着经济的高速发展和人们生活水平的日益提高，在满足物质和精神需求的同时，人们对美的要求也不断提高，迫切需要一种安全、简单、有效的美容方式。微整形应运而生，注射美容手术为微整形的典型代表，其原理为直接将填充物注射于患者皮下或特定部位，来改善局部外观，从而达到美容的效果，已广泛应用于除皱、局部凹陷填充、隆鼻、隆乳等美容手术。关于理想的注射用填充剂的选择一直在探索中，理想的软组织填充剂应具备以下优点：局部注射不引起变态反应或炎症反应；不易机化、变性、坏死或被周围组织吸收；不会因吞噬作用被清除；在形态上具有一定的支撑作用，能保持相对固定的体积和柔韧度；无游走性，塑形效果相对稳定。注射美容手术的发展很大程度上依赖于注射材料的选择，利用脂肪组织工程技术选择合适的注射材料已成为研究热点。

脂肪组织工程技术是利用脂肪干细胞和相应的生物支架材料对病变的组织和器官进行修复重建。选择合适的种子细胞和生物支架材料并建立两者间三维空间结构是脂肪组织工程技术的关键。合适的种子细胞应满足以下几点：增殖能力及分化能力较强，在培养基中加入相应诱导剂可调控其分化方向；生存周期较长，对培养基的要求较低；取材简单，易从相应组织中分离提取。Yoo等[1-2]研究指出合适的细胞支架材料必须符合：支架材料的形态和结构对新生组织生长起到引导作用；起到载体的作用，可将种子细胞输送到指定的空间；可为种子细胞的新陈代谢提供场所，清理代谢所产生的废物，并不断为新陈代谢提供营养；材料表面的特殊位点与种子细胞有特异性的粘附作用；起到机械支架的作用，能够维持组织原有的机械结构；可作为种子细胞活性因子的载体。

1 脂肪组织工程的研究现状

1.1 脂肪组织工程的原理和方法：传统的填充方法包括同种自体移植、同种异体移植、异种异体移植及人工替代品。但这些方法常由于组织细胞的凋亡坏死、延迟的血循重建、组织萎缩等原因而无法达到理想效果[3]。而脂肪组织工程技术被认为是替代传统脂肪移植术最理想的方法。脂肪组织工程技术包含几大重要部分[4]，包括理想的种子细胞，合适的生物支架材料及适宜的微环境。脂肪组织工程技术是利用脂肪干细胞和相应的生物支架材料对病变的组织和器官进行修复重建

1.2 脂肪组织工程的研究策略：关于脂肪组织工程的研究策略，国内外学者经过不断的研究，总结如下：①利用相应的生物支架材料引导组织再生的脂肪组织工程（Scaffold guided tissueregeneration）：将种子细胞与生物支架材料以适当比例混合[5]，植入机体缺损或病变部位，种子细胞不断地增殖分化，支架材料在此过程中为其提供适宜其生长的微环境，同时其在体内不断降解并吸收，从而形成与机体正常组织功能、形态相接近的再生组织，进而形成新的脂肪组织，达到对缺损及病变组织修复及重建的目的；②可注射复合材料脂肪组织工程技术（Injectable composite system）：将凝胶介质与微载体复合材料混合，并注射到机体病变或缺损的部位，微载体凝胶复合物可刺激机体脂肪细胞增殖从而达到对病变或缺损部位修复重建的目的[6-7]；③腹网膜的脂肪组织工程技术[8]（Fragmented omentumbased-tissueregeneration）：腹网膜组织含有丰富的脂肪组织及血管，可为种子细胞的生长提供良好的微环境，将腹网膜组织处理成碎片，并将其与脂肪干细胞混合，植入人体缺损部位，缺损部位脂肪组织大量增加，在一定程度上对缺损部位起到修复重建的目的；④相关生长因子促进脂肪组织再生的脂肪组织工程技术[9-10]（Denovo adipogenesis）：将脂肪干细胞与相关生长因子一同使用，并注射到机体所需要的部位，生长因子可促进脂肪干细胞大量增殖，从而使得分化的脂肪组织大量增加，对病变部位进行修复、对缺损部位进行重建。

1.3 脂肪组织工程的关键：脂肪组织工程的研究策略千变万化，但其关键在于如何选择理想的种子细胞、合适的支架材料。研究发现，以来源于脂肪组织的脂肪干细胞复合相关生物支架作为填充物，可明显促进软组织的血管化、提高移植物的存活率。应用组织工程技术将种子细胞复合不同生物支架作为填充物为临床提供一个新的研究方向。其中种子细胞可以选为脂肪干细胞，细胞支架材料可以选择游离脂肪颗粒和相关注射材料（透明质酸钠、胶原等）。

2 种子细胞的相关研究

2.1 ADSCs的发现和命名：Zuk等[11]于2001年首次从脂肪组织中分离并提取出成体细胞，命名为Processed Lipoaspirate cells（PLAS），即抽脂术细胞，并得到了快速的发展。随着研究的不断深入，学者们也从不同研究角度给予该细胞不同命名。现在比较公认的称为脂肪来源干细胞（ADSCs）。

2.2 ADSCs的分离和纯化： 脂肪干细胞来源广泛，较易于从人体或动物的脂肪组织中分离提取，ADSCs的提取方法很多，但提取出来的都非单一的脂肪干细胞，而是相关的细胞群。在整形外科领域，我们所需的脂肪组织常来源于脂肪抽吸术的患者，将所得脂肪组织用组织剪剪成细小的颗粒，并用PBS液冲洗干净，用0.1%的胶原酶在37℃下进行消化，置DMEM培养进行培养，并加入10%胎牛血清。进行离心，弃其上清液及游离脂肪组织，经过滤纯化后将所得细胞置于培养瓶中进行培养，2天后换液，以后3天换液一次，收集第3代细胞作为种子细胞。我们无法直接纯化脂肪干细胞，常通过纯化脂肪组织来间接达到纯化脂肪干细胞。流式细胞仪检测结果显示：传至第3代时，脂肪干细胞的纯度可达到95%以上。

2.3 ADSCs的生物学特性

2.3.1 ADSCs可分泌多种生长因子：研究发现，脂肪干细胞在一定条件下可产生多种生长因子，如：血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）、肝细胞生长因子（HGF）、胎盘生长因子（PGF）及成纤维细胞生长因子（bFGF）等。其分泌的血管内皮生长因子可促进血管生成、抗凋亡作用、成纤维细胞生长因子具有趋化作用、免疫抑制及造血支持作用。

2.3.2 ADSCs的多向分化能力：脂肪干细胞具有较强的增殖能力和生命周期、排斥反应低、取材简单方便、能建立标准的细胞系等优点。在一定条件下可分化为特定的体细胞，在组织工程研究领域有着巨大价值：① ADSCs可向脂肪细胞分化：Zuk等[12]研究发现，在一定条件培养基中加入适量的胰岛素、地塞米松、吲哚美辛，3周后可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR-r2、lepIin（瘦素）、Glut4（葡萄糖转运蛋白4）等。显微镜下可见空泡结构形成。组织学证明新生的细胞为脂肪细胞；② ADSCs可向血管内皮细胞分化：将ADsCs置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的、特定培养基上进行培养。镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记CD3l和vW因子。Plarlat等[13]研究发现将培养一定时间的ADSCs注入小鼠后肢缺血的肌肉中，15天后，经血管造影及超声检查显示小鼠缺血征像明显改善，此项研究表明ADSCs在一定条件下可向血管内皮细胞分化；③ADSCs向成骨细胞分化：Zuk等、Christian等研究结果显示，在特殊培养基诱导下，h-ADSC8在加入维生素C、B一磷酸甘油（BGP）和维生素D3的培养基中培养几代后，细胞表面形成的突起，其形态与体内的成骨细胞相似，用茜素红染色可见细胞内出现了钙小结，ADSCs形态发生变化，且能表达碱性磷酸酶等相关标记，表现出成骨细胞的特性。国内有学者[14]证实了此点，在体外经成骨诱导后其碱性磷酸酶活性及细胞外基质矿化程度较对照组明显升高，均表现出成骨分化的特性；④向软骨细胞分化：在体外，将维生素C、转化生长因子、胰岛素添加到特定培养基里，可以定向诱导ADscs向软骨细胞分化。结果在培养基里形成了细胞小结，经免疫组化分析得知，这些细胞小结表达Ⅱ型胶原纤维、硫酸软骨素、硫酸角质素[15]。杨亚军[16]用CDMPl体外诱导sD大鼠脂肪干细胞，结果诱导后的脂肪干细胞形态由长梭型向软骨细胞的多角形方向转变。免疫组化显示CDMPI诱导大鼠ADsCs后可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型胶原，并进一步向软骨细胞方向分化增殖[17]；⑤向心肌细胞分化：从脂肪组织中分离的脂肪基质血管组分（SVF）即不含成熟脂肪细胞的脂肪组织，且具有干细胞特性，直接种植在半固体的甲基纤维素培养基中，6d后，出现了各种不同的细胞形态，有成群的前脂肪细胞/脂肪细胞，成纤维样细胞等等，11～14天后，一些圆形的细胞开始了独立的收缩活动，在几天内，肌管样结构出现，并大量生长增殖，20～30天后，局部出现了一簇有结合力的细胞群体，和有分支的纤维细胞共同结合在一起。在这期间，24天时，整个局部出现了单一节律的搏动。在分子水平上，这些搏动的细胞能表达几种心脏特有的mRNA，如：转录因子，GATA-4和心室和心房肌凝蛋白轻链。这些数据表明了这些搏动细胞的心肌细胞特性[18-20]。向神经细胞方向分化：国外一些研究人员用B-巯基乙醇（B-mercaptoethanol，B-ME）诱导h-ADSCs向神经细胞分化，30min后即出现类神经元样的细胞，3h后出现了神经元细胞表型，表达神经细胞早期阶段的标志性因子，这证明了ADSCs能在体外分化为神经前体细胞，目前技术水平尚不能使之向成熟的神经元细胞或星型胶质细胞分化[21-23]。

3 支架材料的相关研究

3.1 支架材料的性质：细胞支架材料是组织工程的核心内容之一，理想的支架材料对组织工程的实验结果会产生巨大的影响，应满足：①可降解性；②排斥反应小，与组织相容性好；③适合种子细胞嵌入的孔径；④合适的表面积及理化性质；⑤其结构强度能与植入部位组织的力学性能相匹；⑥具有一定的可塑性。

3.2 支架材料的作用：支架材料在组织工程中起到了至关重要的作用：①支架材料可引导种子细胞的生长；②为种子细胞的生长提供空间；③提高营养，清除废物；④对不同的种子细胞有特征性连接位点，可使种子细胞特异性粘附于支架材料的特殊位点；⑤不会改变组织本身的形态；⑥可作为某些细胞因子的载体。

3.3 支架材料的种类：脂肪组织、透明质酸和胶原为组织工程中常用的生物支架，也广泛应用于整形外科领域，可以与脂肪干细胞相结合，两者具有一定的协同作用。脂肪颗粒可来源于人体或动物皮下脂肪，取材广泛、简单、足量，且与机体相容性好、排斥性较低，是组织工程中天然的生物支架。研究证明脂肪来源干细胞在向脂肪细胞转化的同时也可向血管内皮细胞分化，并分泌EGF、FGF等生长因子，改善局部血液循环，促进局部细胞增生分裂从而减少细胞缺血时间，降低细胞液化吸收比率，使脂肪来源干细胞和脂肪颗粒两者具有一定的协同作用。透明质酸基本成分为高分子多糖，是世界上公认的保湿剂，在一定条件下极易降解，且免疫排除性较小，已广泛应用于骨科关节疾病的治疗，作为组织工程支架具有广阔的前景。胶原是属于细胞外基质的结构蛋白质，广泛存在于脊椎动物和人的皮肤、肌腱、韧带、软骨及骨等组织或器官中。它的主要成分是糖蛋白。约占机体总蛋白的25%。胶原具有很好的生物学性能，是目前组织工程研究中最常用的天然生物支架材料[24]。在整形外科领域，这三种支架材料已得到了广泛的应用。研究发现，生物支架材料可为种子细胞的生长提供合适的三维空间结构及适宜的微环境，在一定程度上可促进脂肪干细胞的生长和分泌。

4 脂肪组织工程研究展望

自体脂肪移植已广泛应用于临床，是整形外科医生对临床组织缺损患者进行修复重建的一种常规方法，但单纯脂肪移植存活率低、吸收率高，不能达到理想的效果，限制其在临床的进一步应用。利用组织工程技术将种子细胞和相应的生物支架结合，从而构建相应的组织和器官，是组织工程的关键。将种子细胞在体外进行扩增，并与相应支架材料构建三维空间结构，从而形成种子细胞生物支架复合物，并将其植入机体，对病变或缺损的组织和器官进行修复。在此过程中，种子细胞不断扩增，来满足正常组织的需要，相应的生物支架材料为种子细胞的生长增殖提供适宜的微环境，并与机体有良好的相容性，且能不断降解，被机体吸收。从而使种子细胞生物支架复合物能形成与机体在形态和功能上较一致的组织，达到对机体修复重建的目的。

李劼、高建华、鲁峰等[26]将脂肪干细胞与脂肪颗粒以适当比例混合后注射到裸鼠皮下，结果发现，其组织块的湿重、存活率、血管化程度等都显著高于单纯对照组，其研究证明脂肪干细胞与脂肪颗粒混合移植在一定程度上可促进移植物的血管化程度，从而提高存活率、降低吸收率。这与我们的脂肪干细胞复合脂肪颗粒组的研究结果相符合。庞雪芬、张志光[27]将不同浓度的透明质酸与小猪脂肪干细胞混合培养，结果发现适宜浓度的透明质酸可促进脂肪干细胞的增殖分化能力。这与我们的脂肪干细胞复合透明质酸组的研究结果相符合。许颖溦、刘林嶓等[28]将脂肪干细胞与无菌胶原混合形成细胞支架复合物，注射于裸鼠皮下软组织，取材后进行相关检测，其组织块湿重、存活率、微血管密度均显著高于单纯脂肪颗粒移植组，证明无菌胶原作为生物支架在一定程度上可提高脂肪干细胞的促血管化作用。这些研究为组织工程中生物支架的选择提供了理论基础。基于此，脂肪颗粒、透明质酸、无菌胶原做为本实验的生物支架，可加速脂肪干细胞的促血管化作用，从而证明其作为组织工程中的生物支架材料具有一定的可行性。

传统的整形外科手术创伤较大、术后并发症较多、花费高及住院时间长等劣势，不能适应一些迫切需要微整形的患者需要。据美国的一项统计显示，微创整形美容手术的数量逐年上升，充分整形美容手术符合社会发展的趋势，易被广大患者所接受。随着微创整形美容的不断发展，整形美容外科医师的观念也在逐渐转变，微整形已成为一种趋势。 选择合适的种子细胞及支架材料，使得注射美容术安全有效是关键。

5 存在问题

脂肪干细胞作为理想的种子细胞拥有广阔的应用前景，它取材简单、痛苦小、又不涉及相关伦理问题，但是要真正作为一种常规治疗方法应用于临床，还有许多问题需要解决。所用脂肪干细胞由于其供体年龄、性别、取材方法及取材部位的不同可能会对其实验结果造成一定影响，之前研究已经证实，脂肪干细胞的增殖能力跟供体年龄成反比，脂肪干细胞的活性越强，增殖能力也越强。性别在一定程度上也会影响脂肪干细胞的增殖能力，女性脂肪组织中的脂肪干细胞其增殖能力要高于男性。取材部位也在一定程度上影响着脂肪干细胞的生长周期，从腹部组织中提取的脂肪干细胞其生存周期要远高于其他部位，这些有待于进一步研究。在支架材料的应用方面有诸多问题尚未解决，一种材料往往不能满足种子细胞生长的需要，细胞支架材料的研究成了组织工程技术的重点。种子细胞的生长需要合适厚度的支架材料，当支架材料的厚度超过1mm时可能无法为种子细胞提供充沛的营养支持，如何选择合适厚度的支架材料，并为种子细胞的生长提供最适合的微血管环境有待于进一步研究。总之，现阶段研究已经证实，脂肪干细胞复合相关生物支架作为注射美容术中的注射材料具有一定的可行性，且其具有安全、有效、操作简单及并发症少等优点，将成为注射美容的一种趋势，值得临床推广应用。

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[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-26

编辑/李阳利