安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选

马福萌等

摘 要： 利用改良的SDS法提取了153个品种的安徽乌菜DNA，并进行2次重复，均获得了较理想的DNA产物。通过试验确定了安徽乌菜InDel-PCR的10 μL最佳反应体系：1× PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL ， 引物1 μL，Taq E 0.1 μL，DNA 1 μL， ddH2O 6.7 μL； 最佳PCR扩增反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，共36个循环，最后72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 保存。从供试的66对InDel引物中筛选出31对适合安徽乌菜、条带清晰、重复性高、多态性好的引物，为安徽乌菜品种鉴定、遗传多样性分析等奠定了基础。

关键词： 安徽乌菜； DNA提取； InDel； 引物筛选

Abstract： In this research，we extracted DNA 153 varieties of Wucai grown in Anhui with two replication by modified SDS method. We obtained good quality DAN. 10 μL optimum InDel-PCR reaction system was determined by the experiments： 1×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，1 μL primer，Taq E0.1 μL，DNA 1 μL，6.7 μL ddH2O and the best PCR amplification reaction procedure： 94 ℃ pre degeneration in 5 min； 30 s 94 ℃ degeneration，annealing at 55 ℃ 40 s，72 ℃ for 40 s，a total of 36 cycles. The last 72 ℃ was 10 min，and the reaction solution preserved at 10 ℃. From 66 pairs of primers，we selected 31pairs of primers with clear band，high repeatability，and high polymorphism. These InDel markers are useful for Anhui Wucai variety identification and genetic diversity study.

Key words： Anhui Wucai； DNA extraction； InDel； Primer screening

乌菜（Brassica campestris L. ssp. Chinese（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee）别名乌塌菜、塌棵菜、黑菜等，2n=20，是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种 [1]。安徽乌菜原产于江淮之间的北部，是安徽省的著名特产之一[1]，在安徽省的栽培历史悠久，栽培区域也越来越广。目前对乌菜的研究主要致力于高产栽培技术的总结[2]、主要农艺性状及相关分析[3]、植物学性状[4]等方面，而缺乏分子生物学方面的深入研究。

InDel（insertion-deletion）标记是指在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失一段相对短的核苷酸序列而产生的长度多态性变异[5]。它作为分子标记的一种，可以较容易地通过生物信息学的方法获得，InDel标记检测方法具有简单、经济实用、特异性高、稳定性好[6]、分布广[7]等特点，已在亲缘关系鉴定[8]、多态性分析[9]、纯度鉴定[10]、图位克隆[11]等领域被广泛应用。本试验目的是筛选出适合安徽乌菜InDel-PCR反应的引物，为安徽乌菜遗传多样性分析及核心种质构建提供前提条件，对乌菜的种质资源鉴定、重要性状基因定位与乌菜种质创新及新品种选育均具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验时间为2012年9月至2013年5月。供试材料为在安徽省合肥、六安、蚌埠等市收集的安徽乌菜品种及经自交、杂交所得的乌菜材料。本试验所用引物均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 播种后40 d，取幼嫩的叶片提取DNA，2次重复，DNA提取采用改良的SDS法[12]。

1.2.2 引物筛选 选取表现型差异较大的6个不同乌菜材料，利用InDel分子标记进行PCR扩增，筛选出适合的引物。筛选的标准是条带清晰，多态性高，重复性好，无假带。

1.2.3 Indel-PCR反应体系 InDel-PCR反应体系为10 μL，其中包括：1× PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL， 引物1 μL，Taq E 0.1 μL（北京天根生化生物科技有限公司），DNA 1 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，共36个循环，最后72 ℃延伸10 min，10 ℃ 保存。

1.2.4 扩增产物的电泳检测 扩增产物用不同浓度的琼脂糖凝胶电泳和不同浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较，筛选最佳电泳方法。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

随机选取17个DNA样品，在紫外分光光度计上测量其浓度和纯度，其中DNA的OD260/OD280值大多介于1.8～2.0之间；用1% 的琼脂糖电泳检测，乌菜DNA均呈现1条可见的亮带，无明显弥散状（图1），说明无RNA、蛋白质、酚等污染或污染较少，符合Indel-PCR分子标记反应要求。

2.2 电泳方法的选择

本试验分别采用琼脂糖水平电泳与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，结果显示，6%的非变性聚丙烯酰胺垂直电泳条带较清晰，片段长度多在100～250 bp之间（图2）。而琼脂糖水平电泳的DNA条带很弱，难以分辨（图略）。

2.3 Indel标记的引物筛选

本试验从66对引物中淘汰掉无条带、条带模糊、无多态性的引物，初步筛选出条带清晰、多态性好、重复性好的的引物共31对，筛选率为46.97%，扩增出的条带最多为7条，最少为1条。图3为5对引物分别对6个DNA样品的扩增效果图，此图表明此5对引物条带清晰，多态性条带数量为1～4条，片段长度在50～300 bp之间，均可作为乌菜Indel-PCR所需引物。

3 讨 论

本试验采用改良的SDS法提取DNA，利用去污剂SDS使细胞膜、细胞核膜分解，释放出核酸，然后通过氯仿抽取蛋白[13]，使DNA含有较少的蛋白质及其他抑制酶活性物质如多糖等，加入抗氧化剂β-巯基乙醇，防止酚类氧化，然后通过有机试剂异丙醇沉淀出DNA，经紫外分光光度计和1%琼脂糖电泳检测结果表明此方法获得了较纯的DNA。此方法较CTAB法操作简单，方便快捷，比试剂盒提取法节约成本。

本试验所用引物是从白菜上开发出来的，虽经前期验证可用于安徽乌菜Indel分子标记，但并不是每对引物都适合各个品种，并能扩增出清晰的DNA条带。本试验通过大量对比试验确定了适合安徽乌菜的凝胶电泳方法和Indel-PCR反应体系，筛选出31对乌菜Indel-PCR反应的引物，这为以后构建乌菜的核心种质、利用乌菜中的优良基因开展分子标记辅助育种提供了理论依据，也对安徽乌菜种质资源保存、保护和可持续利用以及安徽乌菜分类、起源、演化和育种研究，特别是对防止资源流失，遗传性状的早期鉴定等都具有重要的意义。

参考文献

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