应用SSR分子标记技术鉴定张氏红山茶杂交F1代真实性的研究

李琳琳等

摘要 ：张氏红山茶Camellia changii是新兴的山茶属珍稀种质资源，在茶花杂交育种方面具有极高的科研价值。为建立鉴定张氏红山茶杂交后代的方法，本研究采用SSR标记技术，对以张氏红山茶为亲本的杂交后代以及所有杂交组合的亲本进行了分子鉴定。研究结果显示 ：张氏红山茶和博白大果油茶杂交后代仅有母本特征带，推测其有可能是自交种；张氏红山茶和超级南天武士的杂交后代出现了父母本均没有的条带，显示可能有外来血缘；其余组合杂交F1代均包含了父母本的特征带，从而表明杂交是成功的。从本研究结果看，应用SSR分子标记技术，可以方便地对杂交后代的真实性进行鉴定。

关键词：张氏红山茶；SSR分子标记；杂交一代鉴定

中图分类号：Q37 ；S688

文献标识码：A

文章编号：1671-2641（2014）02-0000-00

Abstract： Camellia changii， a emerging and rare germplasm resources of the genus Camellia， has very high scientific research value in the research field of hybridize breeding. In order to establish a verity identification method of hybrid from Camellia changii， ten F1 hybrids derived from Camellia changii were identified by Simple Sequence Repeat （SSR） markers. The results showed that hybrid derived from combination of C. changii × C. gigantocarpa only merged specific band as female parent， it might be self –bred progeny；hybrid derived from combination of C. changii and C. japonica ‘Dixie Knight Supreme showed no similar band as parents， it might be exogenous consanguinity ， all the other F1 hybrids merged specific bands as parents， it indicate hybridization is successful. Based on the result， verity identification of hybrids could be conveniently carried out by SSR molecular makers.

Key words： Camellia changii； SSR molecular makers； identification of hybrid F1

山茶属植物是著名的茶叶和食用油料资源，也是国际园艺界公认的著名木本花卉，本属的山茶Camellia japonica即为我国的十大名花之一，目前，世界上山茶属植物种类已有280个左右，其中80%以上产于我国，可是作为观赏植物栽培的种类并不多，最常见的有山茶C.japonica、滇山茶C.reticulata、茶梅C.sasanqua、西南红山茶C.pitardii、怒江红山茶C.saluenensis等，并由此选育出上万种观赏茶花品种，在众多育种方法中，杂交育种最重要，据统计，全世界80%以上的茶花品种是通过授粉获得的。寻觅更加与众不同、具有观赏价值的茶花原种来培育新的品种，是茶花育种工作者目前的主要研究工作之一。我国作为山茶属的现代分布中心，茶花植物种质资源相当丰富，其中张氏红山茶Camellia Changii是新近受到重视的珍稀种质资源，它树形优美，枝密花繁，叶光亮全缘，花色鲜红，一年多次开花，不同于其他的茶花品种，成为茶花园艺界热烈追捧的新栽培对象。通过杂交育种改造张氏红山茶花型花色的工作已经开始，对其杂种后代的真实性进行鉴定和评价就显得非常重要。

传统常采用形态学鉴定方法进行杂种鉴定，依靠植株的表型性状来鉴别不同的个体比较直接简便，但有些性状要在特定的生育期才能观测到，时间周期长，有些性状易受环境条件影响，且在对亲缘关系较近的个体的检测上存在不足。近年来广泛应用的分子标记鉴定方法弥补了这方面的不足。合理利用分子标记技术，对品种的真实性进行鉴定，从分子水平上获得最直接的证据，具有准确、快捷、可靠的优点。SSR（Simple Sequence Repeat） 又称微卫星DNA，是目前优秀的遗传标记技术之一，其以信息含量高、显共显性遗传、扩增带型易区分、重复性好等优点，已被广泛用于玉米[1]、棉花[2]、月季[3]等品种纯度和真伪性的鉴定中。在山茶属相关植物研究中，RAPD[4-5]、ISSR[6-7]、AFLP[8-9] 等分子标记已成功应用于亲缘关系鉴定、遗传分析等，然而SSR分子标记技术的成功应用则鲜有报道。

本研究采用SSR分子标记技术对来自张氏红山茶的杂交F1代的真实性进行鉴定分析，以期为张氏红山茶选育种及深入研究张氏红山茶生殖遗传和分子机制提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为广东棕榈园艺股份有限公司培育的F1代幼苗。用于本研究的植物材料及其来源见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 新鲜材料经变色硅胶充分干燥后采用改进的CTAB法[15]进行总DNA提取。

1.2.2 PCR 扩增 经筛选获得两对引物分别为：引物MSCjaH38（5 → 3）：F： TATTGCCTACGACCATTTCCA，R： TTTGAGTTCGTTGCCTTCTCT，引物MSCjaH46（5 → 3）F：AAGAAGAGCAGAGCAACAAGTG，R：CCACACACTTTCCACACTTTTG。扩增程序为：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环，72℃ 5min。PCR反应在PTC-200仪器上完成。

1.2.3 PCR产物的检测 以10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，在800V电压下电泳6～7 h检测PCR扩增产物。电泳结束后聚丙烯酰胺以10%的冰乙酸固定10 min，双蒸水漂洗一次，0.2%的硝酸银银染10 min，经双蒸水漂洗一次，以30%的NaOH和5mL37%甲醛显影，至条带清晰为止，最后用10%冰乙酸固定液终止显影，凝胶以双蒸水漂洗两次，过夜风干后进行扫描。

1.2.4 SSR带谱中F1代真实性鉴定标准 母本来自张氏红山茶的杂交组合后代，在某一引物的SSR带谱中，如果所出现的条带具有父本的特征带，判断为真杂种；如果所出现的条带没有父本的特征带只具有母本的特征带，判断为自交种；如果出现父本和母本均没有的杂带，则认为有外来血缘，判断为假杂种[11～12]。

2结果与分析

由引物MSCjaH38对各亲本和杂交一代的样品进行PCR扩增的结果可以判断：张氏红山茶与红花瘤果茶的F1代、张氏红山茶与浙江红山茶的F1代、媚丽与张氏红山茶的F1代这3个为其真实后代，电泳图谱上显示其子代具有父母双亲的特征带；张氏红山茶与博白大果油茶的F1代和母本带型大小都一致，且不具有父本特征带，有可能为自交种；张氏红山茶和超级南天武士的后代出现了父母本均没有的杂带，认为可能有外来血缘；其他组合父母本与子代仅有数个碱基的差别（图1～2）。

由引物MSCjaH46对各亲本和杂交一代的样品进行PCR扩增的结果可以判别：张氏红山茶与博白大果油茶的F1代仅具有母本的特征带，判断为自交种；张氏红山茶与超级南天武士的F1代出现了父母本均没有的杂带，判断可能有外来血缘；其他组合均可以从电泳图谱上看出其F1代具有父母双亲的特征带，为其真实的杂交后代（图3～4）。

引物MSCjaH38和引物MSCjaH46结果的相互印证表明：大部分杂交后代具有双亲的特征带，为其真实的后代；而张氏红山茶与博白大果油茶的杂交后代无论从引物MSCjaH38还是引物MSCjaH46的扩增结果来看，均显示与母本相同的条带，因此判断其为自交种，杂交没有成功；张氏红山茶与超级南天武士的杂交后代从引物MSCjaH38和 MSCjaH46的扩增结果来看均出现了父母本所不具有的条带，即出现所谓的“新带”，原因可能是在减数分裂形成配子体过程中，染色体减数分裂时同源染色体发生配对与交换，或者染色体复制过程中存在碱基发生突变等。因此，出现一些新的条带，并不必然意味着杂交没有成功，而应通过多对引物的联合分析进一步判断。

3 讨论

3.1 分子标记技术及引物的筛选

通过杂交选育新品种，必须对杂交后代进行真实性的鉴定，这是进一步研究的基础。分子标记是DNA水平上的遗传多态性，受外界环境影响较小，广泛应用于植物种质鉴定、遗传图谱构建、目的基因定位、分子标记辅助育种等领域，并发挥着重大的作用。目前已经发展了几十种标记技术，各标记具有不同的优缺点。本研究首先考虑到ISSR分子标记技术通用引物的优点，采用ISSR分子标记技术对杂交后代的真实性进行鉴定，并挑选出10对扩增良好的引物，但由于其扩增条带数目较多，且呈显性标记，不能鉴定出杂合基因型，而不利于比较分析。因而选择了呈共显性、具有丰富的多态性、且重复性和稳定性好的SSR分子标记技术。SSR的最大优点在于它通过简单的PCR反应即可直接检测到已知的DNA特定染色体位点，而避免使用放射性同位素[13～14]。从相关文献中查到的20对引物中筛选到两对扩增良好的引物[15～17]，能同时扩增出父本和母本的特征带，可用于本研究的杂种鉴定。

3.2 SSR分子标记技术在张氏红山茶杂种真实性鉴定中的应用前景

本研究通过筛选的2对SSR引物，对以张氏红山茶为亲本的F1代杂种进行了鉴定，结果表明：除2个组合外，其余均为真杂种。此外，通过形态观测发现，真杂种在形态特征上更接近于父本，但叶的宽度和锯齿特征明显受到母本的影响，由此可见，形态学性状可对杂交后代进行初步鉴定；但对于自交的假杂种，因其形态性状与母本完全一致，无法准确判断其杂种真实性，必须通过分子标记来进一步鉴定。至于鉴定为真杂种的后代是否在花色上兼具了亲本的优良性状，则有待进一步实验研究。

本文应用SSR分子标记技术成功鉴定了来自张氏红山茶的杂种真实性，这是该技术首次在山茶属种质鉴定中的成功运用。从SSR分析结果中可以看出，SSR分子鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠。可为张氏红山茶选育种及深入研究张氏红山茶生殖遗传和分子机制提供科学依据和技术支持，也将为山茶属植物中杂种的鉴定及其遗传分析应用奠定良好的基础。

参考文献

[1] 谭振馨 ，李汝玉 ，李群 ，等. 玉米杂交种SSR标记纯度鉴定方法研究 [J]. 山东农业科学 ， 2004（4）：8-11.

[2] 朱美霞 ，李英芝 ，王建书 ，等. 利用SSR方法鉴定棉花品种纯度[J]. 安徽农业科学 ，2005， 33（11）：2010-2016.

[3] 罗玉兰 ，张冬梅. SSR标记及形态性状鉴定红刺玫和月季杂交F1代[J]. 植物分子育种 ，2007， 5（6）：839-842.

[4] 罗军武 ，施兆鹏 ，李家贤 ，等. RAPD分子标记技术在茶树亲子鉴定中的应用[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）， 2002， 28（6）： 502-505.

[5] 张景荣 ，刘军. 名贵茶花种质资源的RAPD分析[J]. 西北植物学报， 2006， 26（4）：683-687.

[6 ]侯渝嘉 ，何桥 ，梁国鲁 ，等. 茶树杂交后代的ISSR分析[J]. 西南农业大学学报（自然科学版）， 2006， 28（2）：267-270.

[7] 姚明哲 ，黄海涛 ，余继忠 ，等. ISSR在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析[J]. 茶叶科学， 2005， 25（2）：153-157.

[8] 孙庆磊 ，梁月荣 ，丁兆堂 ，等. AFLP分子标记及其在茶树遗传育种中的应用[J]. 茶叶， 2004， 30（4）：203-206.

[9] 唐绍清 ，杜林方 ，王燕. 山茶属金花茶组金花茶系的AFLP分析[J]. 武汉植物学研究， 2004， 22（1）：44-48.

[10] Doyle JJ， Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochemical Bulletin， 1987， 19： 11-15.

[11] 桃联安 ，经艳芬 ，刘新龙 ，等.云南斑矛F1代SSR分子标记杂种真实性鉴定初步研究[J]. 甘蔗糖业， 2007（2）：7-11.

[12] 桃联安 ，楚联璧 ，经艳芬 ，等.云南割手密82-114种间杂交后代SSR分子标记鉴定[J]. 植物遗传资源学报， 2009， 10（1）：132-135.

[13] Kruglyak S， Durrett R T， Schug M D.， et al Equilibrium distributions of microsatellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point multations[J]. Proc Natl Acad Sci， USA， 1998， 95：10774-10778

[14] Dror Sharon. DNA fingerprints in plants using simple-sequence repeat and minisatellite probes[J]. Hortscience， 1995， 30（1）：109-112

[15] Shiv Shankhar Kaundun & Satoru Matsumoto. Heterologous nuclear and chloroplast microsatellite amplification and variation in tea， Camellia sinensis [J]. Genome， 2002， 45： 1041-1048

[16] Saneyoshi Ueno & Yoshihiko Tsumura. Development of microsatellite and amplicon length polymorphism markers for Camellia japonica L. from tea plant （Camellia sinensis）expressed sequence tags[J]. Molecular Ecology Resources， 2009， 9 （3）： 814-816

[17] Susan freeman， Jon West， Celia James， et al Isolation and characterization of highly polymorphic microsatellites in tea （Camellia sinensis）[J]. Molecular Ecology Notes， 2004， 4 （3）： 324-326