块菌菌根促栖菌研究

摘要

[目的]为了检测细菌对块菌菌根苗的菌根数量、株高和地径的影响，寻找块菌可能的NHBs。[方法] 设置5个菌根组合T. indicum × C. mollissima，T. indicum × Q. franchetii，T. aestivum × C. mollissima，T. aestivum × Q. franchetii和T. melanosporum × C. mollissima为供试菌根组合。选择6株细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、溶桿菌（Lysobacter capsici）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、瓜两面神菌（Janibacter melonis）、氧化烃微杆菌（Microbacterium hydrocarbonoxydans）和球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）作为供试细菌。在块菌接种的过程中在菌剂中分别加入供试细菌和抗生素，在幼苗形成菌根后对菌根苗的菌根进行计数，并且测量株高和地径。[结果] 苏云金牙孢杆菌可以极显著地促进Ti×Qf菌根苗的菌根数量和地径，球形节杆菌极显著地促进Tm×Cm菌根苗的菌根数量。这两种细菌可以应用于实验大棚接种。

[结论]

同一细菌对于不同的菌根组合形成的菌根数量、菌根苗株高和地径具有真菌特异性。它会促进某些菌根组合的菌根数量、菌根苗株高和地径形成，但会抑制另外一些菌根组合的菌根数量、菌根苗株高和地径。同时，块菌子囊果内土著细菌对于所有供试菌根组合形成的菌根数量都有显著促进作用，但对于菌根苗株高和地径的影响在不同组合中不一致。

关键词块菌；菌根；根际微生物；菌根促栖菌

中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-13179-06

Abstract[Objective]The objective was to test the influence of bacteria on mycorrhizal number， height and basal diameter of Tubermycorrhizaed seeding. [Method] Five mycorrhizal combinations， T. indicum × C. mollissima，T. indicum × Q. franchetii，T. aestivum × C. mollissima，T. aestivum × Q. franchetii and T. melanosporum × C. mollissima were synthesized. Six bacteria Bacillus thuringiensis， Lysobacter capsici， Bacillus cereus， Janibacter melonis， Microbacterium hydrocarbonoxydans and Arthrobacter globiformis were selected. Bacteria and antibiotic were added into inoculum respectively when mycorrhizal synthesis. After forming mycorrhizae， mycorrhizal number was counted， as well as height and basal diameter of seeding were measured.

[Result] Bacillus thuringiensis could promote mycorrhizal number and basal diameter of seedings of Ti × Qf significantly. Arthrobacter globiformis could promote mycorrhizal number of Ti × Qf seedings significantly. Bacillus thuringiensis and Arthrobacter globiformis were potential bacteria to be used in Tuberinoculated seedings. [Conclusion]Indigenous bacteria could promote the mycorrhizal formation of Tuber. Selected bacteria could promote mycorrhizal formation， height or basal diameter of seeding in one mycorrhizal combination， but inhibit in another mycorrhizal combination.

Key wordsTuber spp.； Mycorrhizae；Indigenous bacteria；Mycorrhization helper bacteria

大多数陆生植物的根系都会和菌根菌形成菌根。这是一种互惠共生的关系，在自然界中分布十分广泛[1]。菌根真菌能否顺利地侵染植物的根并且形成菌根，不仅取决于其周围的非生物因素如土壤pH、肥力、湿度和温度，而且取决于一些生物因素如土壤微生物[2]。菌根对其根际微生物有选择和调节的作用，根际中的有些微生物也能促进菌根的形成和改变菌根菌的基因表达[3-4]。Duponnois等[5]从蜡蘑（Laccaria laccata）和黄杉（Pseudotsuga menziesii）形成的菌根上分离出细菌，在大棚里用黄杉接种蜡蘑，分别加入分离得到的45株细菌，发现4个月后有14株细菌都显著地提高了菌根的侵染率，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）使得菌根侵染率从67.3%提高至97.3%。他们把这些能够促进菌根形成的细菌称为菌根促栖菌（Mycorrhization Helper Bacteria， MHBs）。

MHBs普遍存在于外生菌根根际中，其重要特征就是具有其真菌特异性。MHBs经常会促进某些菌根组合的形成，但会抑制另外一些真菌形成菌根[6]。研究表明，荧光假单胞菌BBc6菌株可以显著促进红蜡蘑和北美黄衫形成菌根[5]，但同一株菌株显著地抑制红蜡蘑和加利桉树菌根的形成[7]。

块菌属（Tuber F. H. Wigg.）是一类具有重要经济和生态价值的子囊菌门地下生的外生菌根真菌。块菌中的一些种类具有较高的营养价值和极高的经济价值，如意大利白块菌（T. magnatum Pico）、黑孢块菌（T. melanosporum Vittad.）和印度块菌（T. indicum Cooke & Massee）等。開发块菌资源具有重要意义。到目前为止，块菌还未实现人工栽培，现在块菌栽培所采用的是半人工栽培（Semiartificial cultivation）的方法，其关键就是使得块菌和寄生宿主之间形成菌根关系。在块菌的半人工栽培过程中，关于影响菌根形成的非生物因素如pH、基质配比等已有很多的研究，但关于在块菌形成菌根过程中根际微生物所扮演的角色至今尚无研究。所以，研究块菌的MHBs具有很重要的应用价值。目前已有报道显示，从波氏块菌和意大利白块菌（T. magnatum）的子囊果中分离出的细菌可以显著促进块菌菌丝的生长，它们中的大多数都是革兰氏阴性菌[8-12]。但是，至今未发现有关促进块菌菌根形成MHBs的报道。

1材料与方法

1.1研究材料

1.1.1供试菌根组合。

选择冷冻储藏的印度块菌（T. indicum）、夏块菌（T. aestivum Vittad.）和黑孢块菌（T. melanosporum）作为该次试验的菌剂，其中印度块菌于2009年2月购于昆明水木花菌子市场，夏块菌于2009年10月底购于四川会东县，黑孢块菌于2009年11月购于法国。

选择板栗（Castanea mollissima）和锥链栎（Quercus franchetii）幼苗作为寄主植物。供试板栗种子购买昆明市场，于2009年3月底育苗；供试锥链栎种子采自于昆明植物所木本园内，于2009年10月31日育苗。

设置5个菌根组合菌：T. indicum × C. mollissima（Ti × Cm）， T. indicum × Q. franchetii（Ti × Qf）， T. aestivum × C. mollissima（Ta × Cm）， T. aestivum × Q. franchetii（Ta × Qf）和T. melanosporum × C. mollissima（Tm × Cm）。

1.1.2供试细菌。

2010年4月9日，取块菌菌根际土壤，分离纯化得到96株细菌。选择其中6株细菌作为供试细菌，分别为B1（Bacillus thuringiensis，苏云金芽孢杆菌）、B2（Lysobacter capsici，溶杆菌）、B3（Bacillus cereus，蜡状芽孢杆菌）、B4（Janibacter melonis，瓜两面神菌）、B5（Microbacterium hydrocarbonoxydans，氧化烃微杆菌）、B12（Arthrobacter globiformis，球形节杆菌）。

1.2研究方法

1.2.1供试细菌的分离纯化和鉴定。

在发现块菌菌根后，以其为中心，取半径1 cm以内的土样，放入15 ml离心管中保存，带回实验室分离培养。采用TSA培养基，在LRH250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）中28 ℃条件下培养。通过对分离培养的单菌落进行扩大培养后，采用分子生物学的方法，对其16sRNA片段进行扩增并测序，然后通过序列比对NCBI上的Blast功能进行鉴定。

1.2.2试验处理。

设3个处理：①菌剂中什么都不加（CK），②菌剂中加入抗生素，③菌根中加入细菌。

由于块菌子囊果内包含有很多的土著细菌，所以在实验过程中，在向待接种的块菌菌剂中加入抗生素。研究表明，氯霉素-钠的浓度在160万单位时，印度块菌、夏块菌和黑孢块菌菌剂中的细菌能被有效抑制。

菌根接种时，向印度块菌、夏块菌菌剂中分别加入B1、B2、B3、B4、B5和B6。由于黑孢块菌数量有限，仅将B1和B12这2种细菌用于Tm × Cm组合中。所有接种时加入的细菌菌液均为培养48 h的菌液。供试菌根苗加入的细菌菌液均为12 ml/株。

1.2.3菌根合成方法。

将灭菌处理的基质调解至所需pH水平，根据每株苗需要的接种浓度为5×106个孢子，需要的细菌量为培养48 h的菌液12 ml，向基质分别加入块菌菌剂和细菌菌液，充分混匀，将剪过的幼苗移栽至装有该基质的容器内。5种菌根组合的每个处理均接种20棵菌根苗，则Ti × Cm、Ti × Qf、Ta × Cm和Ta × Qf组合各接种160株，Tm × Cm接种80株，总计接种菌根苗720株。

1.3数据处理

每个处理各取15个样本，对菌根苗的菌根进行计数，并且测量株高和地径。进一步对不同处理之间数据的差异进行ANOVA分析，其中a*b的P值<0.05，b*c的P值<0.05，a*c的P值<0.01。

42卷36期邓晓娟等块菌菌根促栖菌研究

2.4不同处理对菌根数量的影响

不同处理对菌根苗的菌根数量、株高和地径有抑制作用（-）、促进作用（+）或无影响（0）。由表1可知，在菌剂中加入抗生素后，对5个菌根组合形成的菌根数量均有显著或极显著的抑制作用。加入细菌B1后，对Ti × Qf 的菌根数量有极显著的促进作用，但也极显著地抑制了Ti × Cm的菌根数量，显著地抑制了Ta × Cm和Ta × Qf的菌根数量，对Tm × Cm的菌根数量有促进作用，但这种促进作用在统计学上无意义。在加入细菌B2后，极显著地抑制了Ti × Cm的菌根数量，对Ta × Qf的菌根数量有抑制作用，但这种抑制作用在统计学上无意义，对Ti × Qf 和Ta × Cm的菌根数量没有影响。加入细菌B3后，极显著地抑制了Ti × Cm的菌根数量，对Ta × Cm的菌根数量有抑制作用，但这种抑制作用在统计学上无意义，对Ti × Qf 和Ta × Qf 的菌根数量没有影响。加入细菌B4后，显著地抑制了Ti × Cm和Ta × Qf的菌根数量，对Ta × Cm的菌根数量有抑制作用，但这种抑制作用在统计学上无意义，对Ti × Qf的菌根数量没有影响。加入细菌B5后，极显著地抑制了Ti × Cm的菌根数量，显著地抑制了Ta × Qf的菌根数量，对Ti × Qf的菌根数量有促进作用，对Ta × Cm的菌根数量有抑制作用，但都没有统计学意义。加入细菌B12后，极显著地抑制了Ti × Cm、Ta × Cm和Ta × Qf的菌根数量，极显著地促进了Tm × Cm的菌根数量，对Ti × Qf的菌根数量没有影响。

在块菌菌剂中加入抗生素后，抑制了菌剂本身所带细菌的生长，对5个不同菌根组合形成菌根的数量都具有显著或极显著地抑制作用，进而说明块菌子囊果内土著细菌对于菌根的形成有显著的促进作用。

菌根促栖菌的重要特征就是具有真菌特异性。MHBs经常会促进某些菌根组合的形成，但会抑制另外一些真菌形成菌根[6]。B1对于Ti + Qf菌根形成有极显著促进作用，但对于Ti + Cm、Ta + Cm和Ta + Qf有显著或极显著地抑制作用。B12对Tm + Cm菌根形成有极显著促进作用，但对于Ti + Cm、Ta + Cm和Ta + Qf有极显著地抑制作用。

2.5不同处理对株高的影响

由表2可知，在菌剂中加入抗生素后，极显著地抑制了Ta × Cm和Ta × Qf菌根苗的株高，抑制了Tm × Cm的株高，促进了Ti × Qf的株高，但都不具有统计学上的意义，对Ti × Cm的株高没有影响。加入细菌B1后，显著地抑制了Ta × Cm的株高，抑制了Ti × Cm和Ta × Qf的株高，但不具有统计学上的意义，对Ti × Qf和Ta × Qf的株高没有影响。加入细菌B2后，极显著地促进了Ti × Cm的株高，对Ti × Qf的株高有促进作用，对Ta × Cm有抑制作用，但都不具有统计学上的意义，对Ta × Qf的株高没有影响。加入细菌B3后，极显著地促进了Ti × Qf的株高，对Ti × Cm和Ta × Qf的株高有促进作用，对Ta × Cm的株高有抑制作用，但都不具有统计学上的意义。加入细菌B4后，极显著地促进了Ti × Qf的株高，对Ti × Cm的株高有促进作用，但不具有统计学上的意义，对Ta × Cm和Ta × Qf的株高没有影响。加入细菌B5后，对Ta × Qf的株高有促进作用，但不具有统计学意义，对Ti × Cm、Ti ×Qf和Ta × Cm都没有影响。加入细菌B12后，极显著地抑制了Ta × Qf的株高，极显著地促进了Ti × Qf的株高，对Ti × Cm和Tm × Cm有促进作用，对Ta × Cm有抑制作用，但都不具有统计学上的意义。

由表2可知，在块菌菌剂中加入抗生素（Anti）后，抑制了菌剂本身所带细菌的生长，对形成的菌根苗的株高的影响表现不一致，其中对于Ta + Qf和Ta + Cm组合的株高有极显著的抑制作用。子囊果内土著细菌对于不同组合的块菌菌根苗的株高影响表现不一致。

细菌对于菌根苗的株高的影响也具有真菌特异性，B12极显著地促进了Ti + Qf的株高，但同时极显著地抑制了Ta + Qf的株高。

2.6不同处理对地径的影响

由表3可知，在菌剂中加入抗生素后，極显著地抑制了Ta × Cm菌根苗的地径，抑制了Ta × Qf的地径，促进了Tm × Cm的地径，但都不具有统计学上的意义，对Ti × Cm和Ti × Qf的地径没有影响。加入细菌B1后，极显著地抑制了Ti × Cm的地径，极显著地促进了Ti× Qf的地径，抑制了Ta × Cm和Ta × Qf的地径，促进了Tm × Cm的地径，但都不具有统计学上的意义。加入细菌B2后，促进了Ti × Cm和Ti × Qf的地径，但都不具有统计学上的意义，对Ta × Cm和Ta × Qf的地径没有影响。加入细菌B3后，极显著地促进了Ti × Qf的地径，对Ti × Cm、Ta × Cm和Ta × Qf的地径没有影响。加入细菌B4后，极显著地促进了Ti × Qf的地径，对Ta × Cm和Ta × Qf的地径有促进作用，但都不具有统计学上的意义，对Ti × Cm的地径没有影响。加入细菌B5后，显著地促进了Ti × Qf的地径，对Ti × Cm和Ta × Qf的地径有抑制作用，对Ta × Cm的地径有促进作用，但都不具有统计学上的意义。加入细菌B12后，极显著地促进了Ti × Qf的地径，极显著地抑制了Ta × Qf的地径，对Ti × Cm和Ta × Cm有抑制作用，对Tm × Cm有促进作用，但都不具有统计学上的意义。

在块菌菌剂中加入抗生素（Anti）后，抑制了菌剂本身所带细菌的生长，对形成的菌根苗的地径的影响表现不一致，其中对于Ta + Cm组合的地径有极显著的抑制作用。子囊果内土著细菌对于不同组合的块菌菌根苗株高的影响表现不一致。

3结论

（1）细菌对于不同的菌根组合形成的菌根数量具有真菌特异性。它会促进某些菌根组合的形成，但会抑制另外一些真菌形成菌根。块菌子囊果内土著细菌对于菌根的形成有显著促进作用。

（2）细菌对于不同组合的菌根苗株高也具有真菌特异性。它会促进某些组合的菌根苗株高，但会抑制另外一些组合的菌根苗株高。块菌子囊果内土著细菌对于不同组合菌根苗株高的影响不一致。

（3）细菌对于不同组合的菌根苗地径也具有真菌特异性。它会促进某些组合的菌根苗地径，但会抑制另外一些组合的菌根苗地径。块菌子囊果内土著细菌对于不同组合菌根苗地径的影响不一致。

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