橡子淀粉乙醇化酵母菌种的筛选

栾泰龙等

摘要

[目的] 筛选适于以橡子淀粉为发酵原料的高性能优良酵母菌种。 [方法]从几种工业上较常用的酒精用酵母中，筛选适合于橡子淀粉质原料发酵的菌种，对它们的发酵性能、酒精产量、残糖含量等方面进行分析比较。[结果]分析得出，南阳6号酵母较其他菌株的酒精产率高、残还原糖低，发酵性能优良；而兰州L166发酵性能较高，同时耐受性好，南阳6号与兰州L166是所选取的菌株中较适合橡子淀粉发酵生产燃料乙醇的菌株。[结论]在实际生产过程中，应根据橡子原料中成分的不同对相应菌种加以选用。

关键词橡子；发酵；酿酒酵母；筛选

中图分类号S188+.4文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-13028-03

Abstract[Objective] To screen out high performance excellent yeast strains with acorn starch as fermentation raw material. [Method] The appropriate strains were selected from several commonly used yeasts in industry， the fermentation performance， alcohol yield and the content of residual sugar were compared. [Result] Compared with other strains， yeast of Nanyang No.6 has higher alcohol yield， lower residual reducing sugar， and excellent fermentation performance； Lanzhou L166 has higher fermentation performance and good tolerance， Nanyang No.6 and Lanzhou L166 are appropriate strains for producing ethanol by acorn starch fermentation. [Conclusion] In practical production process， appropriate strains should be selected according to composition of acorn raw material.

Key words Acorn； Fermentation； Yeast for ethanol production； Screening

燃料乙醇属于可再生能源，是一种绿色、清洁的能源。燃料乙醇的抗爆性能良好，将其用作车用燃料能够使燃烧更加充分， 大大降低汽车尾气排放量， 降低对环境的污染。燃料乙醇作为替代石油能源的绿色可再生能源日益受到人们的关注。大量使用燃料乙醇除了对环境的保护益处明显外，还降低了国家对进口石油的依赖程度、降低能源支出在社会消费中所占的比例等，使用燃料乙醇意义重大[1-2]。

我国栎类资源丰富、分布区域广泛，橡子种仁中淀粉含量高，是代替粮食作物制备生产燃料乙醇的理想来源[3]。燃料乙醇的生产目前主要采用发酵法，发酵时淀粉水解为可发酵性糖，进而被微生物转化为乙醇和二氧化碳，在这个过程中菌株发酵性能的高低就成为了影响淀粉利用率和酒精产量的关键因素。以橡子淀粉为发酵原料的菌种应具有酒精产量高、淀粉利用率好、适应性强、抗性好等特点[4]。筛选以橡子淀粉为发酵原料的优良酵母菌种，不仅可以提高酒精发酵质量和淀粉出酒率，而且能降低原料消耗及生产成本。笔者选取几种工业上较常用的酒精用酵母，从发酵菌株的发酵性能、酒精产量、残糖含量及耐性等方面进行试验，以期得到适于橡子发酵的高性能酵母菌种。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试菌种。黄海109、兰州L166、天津R12、济南Rasse12、南阳5号、6号，分别编号为XZ01～XZ06，以上酵母菌种由黑龙江省微生物研究所提供。

1.1.2

主要试剂。葡萄糖、酵母膏、氯化铵、硫酸镁、蛋白胨、磷酸二氢钾、3，5二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠，苯酚、亚硫酸钠、盐酸、无水乙醇等，均为分析纯。

1.1.3

主要仪器。XFS280A手提式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；HWS28电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；722N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；HPX9272 MBE数显不锈钢电热培养箱，上海博讯实业有限公司；RE 5286A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.1.4

培养基。YPD培养基：蛋白胨 2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，pH 6.0（固体培养基加琼脂1.5%～2.0%），115 ℃灭菌15 min。发酵培养基：葡萄糖15.0 g，酵母浸膏0.5 g，NH4Cl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.06 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO4 0.1 g， 用蒸餾水定容至100 ml，培养基pH用H2SO4调节至4.5，121 ℃温度下灭菌20 min。

1.2试验方法

试验选取南阳6号等6种酒精用酵母为发酵菌株，通过对发酵菌株的产酒精能力、产气量、残糖含量等方面的进行比较，以得到适合于橡子淀粉发酵的高性能酵母菌种。

1.2.1

酵母产气性能试验。将待试的不同酵母菌株活化好后接种至250 ml三角瓶中，接种量2%，将三角瓶置于28 ℃条件下恒温发酵至结束。CO2失重的测定：采用直接称重法，每经过24 h将三角瓶称重1次直至发酵自然停止，计算接种发酵后在单位时间内CO2的释放量。

1.2.2

产酒精能力的测定[5]。酒精含量的测定：采用比重计法。发酵结束后取100 ml发酵醪液置于500 ml蒸餾瓶内，并加100 ml蒸馏水，加热蒸馏直至馏出 100 ml溶液，用酒精比重计测定馏出液中的酒精度，同时测定馏出液的温度，并换算为20 ℃时的酒精浓度。

1.2.3

残糖含量的测定[6]。发酵结束后取5 ml醪液过滤，将滤液稀释至100 ml容量瓶，用DNS法测定。

1.2.4

酵母耐性试验。将酵母分别接入含不同乙醇浓度（0%vol、3%vol、6%vol、9%vol、12%vol）、葡萄糖浓度（100、200、300、400、500 g/L）、单宁浓度（1%、2%、3%、4%、5%）的发酵培养基中，28 ℃条件下恒温发酵，分别测量发酵后的OD560值。

2结果与分析

2.1 酵母发酵性能结果

在发酵过程中，酿酒酵母经过不断利用底物原料产生酒精，并释放出CO2，发酵液重量随之减少。但是各酵母菌株的代谢能力有一定差异，对底物原料的利用程度不同，导致最终产气量存在差别。

通过测定发酵后几株酵母的产气量，并将其记录下来，以CO2产生量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制CO2产生量曲线，结果见图1。由图1可以看出，在接种24 h内几种菌株都能快速地开始发酵，并且以菌株XZ02产气量较多，随着发酵过程的进行，各菌株的产气量均有增加，尤其以24～72 h内产气量增幅最大，而在发酵72 h后CO2产生量逐渐下降。发酵终止时，累计发酵产气量以菌株XZ02略高，而其他几个酵母菌株与其相比，产气量依次降低。

2.2酒精产量及残糖含量的测定结果

各菌株接入培养基后经过发酵，试验结果显示，XZ06在发酵结束后产酒精量最多，为14.2%vol，XZ04其次。对发酵液中的酒精含量进行单因素方差分析，发现各菌株发酵后XZ06、XZ04的酒精含量显著高于其他4种酵母菌（P<0.05），产酒精能力较强。

残还原糖含量低，表明发酵液中原料利用充分。通过试验结果可以看出，发酵后菌株XZ03的残糖含量最低，为7.12 g/L，XZ06其次。对发酵后的残糖含量进行单因素方差分析发现，发酵后XZ03、XZ06的残糖含量显著低于其他4种酵母菌（P<0.05），表明这2个菌株利用糖类的能力较强，能使发酵进行的比较彻底。

2.3酵母耐性试验结果

2.3.1

乙醇耐性试验。

将活化好的酵母菌分别接入不同酒精浓度的发酵培养基中发酵，截取发酵48 h时的酵母生长情况，比较它们在不同酒精浓度条件下的生长情况，其结果见图3。

从图3中可以看出，在初始发酵液中酒精浓度为0%vol～6%vol的条件下，发酵48 h后几种酵母的吸光度值逐渐下降，其中以XZ05、XZ06下降速率较快，XZ01、XZ02 2个菌株下降较平稳。当在初始发酵液中酒精浓度达到6%vol～12%vol的条件时，经过48 h发酵，6种菌株的吸光度值下降均较快，说明在较高酒精浓度条件下，各菌种的酒精耐受能力下降较大，但最终以XZ01、XZ02的吸光度值略高。从各种酵母菌株的酒精耐受比较结果可以看出，XZ01、XZ02比其他酵母菌株具有更强的耐受酒精能力。

2.3.2

糖浓度耐性试验。

将活化好的酵母菌分别接入不同葡萄糖浓度的发酵培养基中发酵，测定发酵培养基经24 h发酵后的吸光度值，比较各菌株在不同葡萄糖浓度条件下菌体的生长情况。通过图4显示出，当发酵液中糖浓度在100～200 g/L时，经过一段时间的发酵培养，各酵母菌株发酵液的吸光度均较大。随后随着糖浓度的增大，各菌株的吸光度均减小，说明发酵液中的糖浓度含量在100～200 g/L时更适合这几种酵母菌株的生长。当糖浓度升高到500 g/L时，各酵母生长都趋于缓慢，同时XZ01～XZ04吸光度接近，但高于XZ05、XZ06。

发酵结果表明，当发酵液中糖浓度较低时，几种菌株发酵状况良好，当发酵液中糖浓度较高时，XZ05、XZ06的糖耐受性低于其他菌株。初始的发酵糖浓度对酵母菌生长存在一定的影响，因此，在以橡子淀粉为发酵原料的培养基中应根据淀粉水解程度选择适合于发酵的酵母菌。

2.3.3

单宁浓度试验。

各酵母菌种在含不同浓度单宁的培养基中经过24 h发酵，其结果如图5。从图5中可以看出，发酵过程随单宁浓度的升高整体呈下降趋势。XZ01、XZ03 2个菌株在各个浓度下均生长缓慢，XZ04在1%～2%单宁浓度范围内吸光度值下降较快，表示这3个菌株在低单宁浓度时即受到较大抑制，其他3个菌株在各浓度条件下吸光度值下降均匀，其中XZ02的吸光度值相对较高，在5%单宁浓度条件下XZ06吸光度最大，

3 结论

橡子中淀粉含量高，是潜在的重要淀粉质原料来源，以橡实淀粉为原料制备燃料乙醇具有良好的物质基础。通过上述试验结果，分别从酒精产率和菌株耐性等方面综合考虑，南阳6号较其他菌株的酒精产率高、残还原糖低，发酵性能优良；而兰州L166发酵性能较高，同时耐受性好，南阳6号与兰州L166是所选取的菌株中较适合橡子淀粉发酵生产燃料乙醇的菌株。在实际生产过程中，应根据橡子原料中成分的不同对相应菌种加以选用。

参考文献

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[2] 苏小军，熊兴耀，谭兴和，等.燃料乙醇发酵技术研究进展[J].湖南农业大学学报，2007，33（4）：480-484.

[3] 田玉峰，李安平，谢碧霞，等.橡实淀粉生物乙醇化橡实品种和菌种的筛选[J].食品科学，2011，32（7）：207-210.

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[5] 李安平，谢碧霞，沈伟，等.橡实淀粉发酵生产酒精专用酵母菌株的筛选[J].中南林业科技大学学报，2012，32（8）：98-102.

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