红三叶草固态发酵物对肉仔公鸡免疫机能的影响

孟翠红　张福元

摘要

[目的]利用红三叶草固态发酵物饲喂肉仔公鸡，分析红三叶草固态发酵物对其免疫机能的影响。[方法] 选用1日龄健康艾维茵肉仔公鸡600只随机分为5组，在基础日粮中添加0.1%、0.2%、0.3%红三叶草固态发酵物（RSF）和红三叶草提取物，研究发酵红三叶草对肉仔公鸡免疫机能的影响。[结果] 28日龄，0.1%RSF组肉仔鸡T、B淋巴细胞增殖反应比对照组分别提高9.1%和8.3%（P<0.05）。在基础日粮中添加0.1%、0.3%RSF和红三叶草提取物均能显著提高肉仔鸡的胸腺指数（P<0.05）。在基础日粮中添加0.1%RSF能显著提高49日龄肉仔鸡的脾脏指数（P<0.05）。 在基础日粮中添加0.1%RSF和红三叶草提取物均显著提高22日龄肉仔鸡的法氏囊指数（P<0.05）。[结论] 该研究可为利用米曲霉固态发酵红三叶生产饲料添加剂提供理论依据。

关键词红三叶固态发酵；肉仔鸡；免疫机能

中图分类号S541+.9文献标识码A文章编号0517-6611（2014）36-12915-03

Abstract [Objective] The male broilers were fed with red cloversolid state fermentation to analyze their effects on the immune functions of male broilers. [Method] 600 onedayold healthy male Avian broilers were randomly divided into 5 groups. 0.1 %， 0.2%， 0.3% red cloversolid state fermentation （RSF） and red clover extract were added in the basal diet to study the effects of red cloversolid state fermentation on the immune functions of male broilers. [Result] The proliferation rates of T and B lymphocytes 28dayold broilers in 0.1% RSF group increased 9.1% and 8.3% than that in control group（P<0.05）. The thymus index of broilers could be significantly increased by adding 01%，0.3% RSF and red clover extract in the basal diet（P<0.05）. Adding 0.1% RSF in the basal diet could significantly increase the spleen index of 49dayold broilers（P<0.05）. Adding 0.1% RSF and red clover extract in the basal diet could significantly increase the fabricius index of 22dayold broilers（P<0.05）. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for producing feed additives with solidstate fermentation products of red clover with Aspergillus oryzae.

Key words Red cloversolid state fermentation （RSF） ； Broilers； Immune function

紅三叶草，又名红车轴、红荷兰翘摇等，是豆科三叶草属多年生草本植物。红三叶草在我国吉林、新疆、湖北山地、云贵高原等地区都有野生分布，在我国江淮流域、华南、西南等地区均有栽培，是我国长江流域以南及甘肃省高寒阴湿地区优良的豆科牧草[1]。研究表明，红三叶含有丰富的异黄酮类物质（如芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、红车轴草素、大豆素等[2]），具有植物雌激素和抗氧化的生理活性功能[3-5]，能促进动物生长，增强机体免疫力，调节动物繁殖等[6-7]。

红三叶草虽然含有丰富的异黄酮，但是由于植物细胞壁的高纤维结构会阻碍异黄酮从细胞内渗出进入肠道内，从而使异黄酮还未渗出利用就已随着粪便排出，使得异黄酮的利用率大大降低。米曲霉是梗孢科曲霉属中常见的一个真菌种，是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种，也可用于生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等[8]。研究表明，米曲霉发酵所产纤维素酶的活性高[9]，利用米曲霉的这个特性发酵红三叶草，制得集纤维素酶与异黄酮于一体的发酵物，既可使异黄酮在动物体内被充分利用，又有助于饲料中的纤维素和其他成分的消化。另外，用曲霉菌固态发酵红三叶草产纤维素酶的研究表明，经过发酵后的红三叶内异黄酮的渗出力提高了近1倍[10]。笔者利用红三叶草固态发酵物饲喂肉仔公鸡，通过对其免疫机能的影响研究，旨在为利用米曲霉固态发酵红三叶生产饲料添加剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1 试验材料

红三叶草购自甘肃岷海制药有限公司，40目粉碎，测得总黄酮含量为2.2%。

红三叶草固态发酵物（Redcloversolidstatefermentation，RSF）是利用米曲霉A.niger 3.3148菌株（产纤维素酶活高）在最佳发酵条件下发酵红三叶草，14 d后低温干燥制得。实际测得发酵物中含纤维素酶2 000 U/g、果胶酶1 560 U/g、糖化酶396 U/g、酸性蛋白酶196 U/g、米曲霉活菌数为5.3×106 cfu/g，总黄酮含量为2.3%。

红三叶草提取物购自兰州天萃生物技术有限公司，其主要成分为刺芒柄花素、鹰嘴豆芽素A、染料木素及大豆素，总黄酮含量为98%。

BrduELISA试剂盒为Biochringer Mannheim公司产品，Percoll细胞分层液为Pharmacia公司产品，RPMI-1640培养基为Gibcobrl公司产品，LPS（细菌脂多糖）和ConA（刀豆素A）为Sigma公司产品。

1.2试验动物及基础日粮

试验选用600只1日龄健康的艾维茵肉用公雏，平均体重为（40.39±1.48）g，将其随机分为5个试验组，每组3个重复，每个重复40只鸡。

基础日粮以玉米-豆粕为主要原料，分生长前期（0～3 w）和生长后期（4～7 w）2个阶段配制试验日粮，各处理组除添加物及剂量不同外，其他营养水平相同。各处理组基础日粮配方及营养水平见表1～2。

1.3试验设计

试验采用完全随机设计，共分5个试验组，分别为基础日粮对照组（Ⅰ组）、基础日粮+0.1%RSF（Ⅱ组）、基础日粮+0.2%RSF （Ⅲ组）、基础日粮+0.3%RSF （Ⅳ组）、基础日粮+20 mg/kg红三叶草提取物（Ⅴ组），试验期7 w。

1.4饲养管理

分3层笼养，鸡舍采用暖气供热，第1周室温为33～35 ℃，以后每天降温0.5 ℃左右，从第5周开始环境温度可保持在20～24 ℃。自由采食饮水。3日龄以前24 h光照，4～15日龄12 h光照，以后每周增加4 h光照时间，从第5周开始给予23 h光照和1 h黑暗至结束。光照强度第1～2周为10 lx，第3周可降到5 lx至出栏。7日龄时第1次注射新城疫弱毒苗进行首次免疫，14日龄采用饮水进行法氏囊疫苗免疫，21日龄采用饮水进行新城疫弱毒苗二次免疫。试验期间，经常观察鸡群采食饮水、粪便以及精神状况，做好称料和死亡等记录。

1.5测定项目与方法

1.5.1

T、B淋巴细胞转化率。于28日龄清晨从各处理组中取体重相近的健康鸡3只，无菌心脏采血（外周）血，用肝素抗凝。采用Percoll细胞分层液来分离淋巴细胞。将制备好的淋巴细胞加入到96孔细胞培养板中，50 μl/孔，以ConA和LPS分别作为T、B淋巴细胞丝裂源，浓度分别为45.0和22.5 μg/ml，每个处理3个复孔，置于40 ℃ 5% CO2培养箱中培养，细胞培养60 h后，每孔加入10 μl Brdu标记二抗及显色，具体步骤按照试剂盒要求进行，最后使用318MC酶标仪测定T、B淋巴细胞增殖OD450 nm值。

1.5.2

免疫器官指数。22、36、49日龄清晨从各处理组随机取体重均一的健康鸡6只，进行屠宰，摘取其左侧胸腺、脾脏和法氏囊，用吸水纸吸干，剔除脂肪后称量鲜重，计算免疫器官绝对重量及指数，以g/kg体重表示。

1.6数据处理

采用SPSS （10.0） 软件的ONEWAY ANOVA进行方差齐次性检验，再进行F 检验和LSD多重比较。

3 讨论与结论

淋巴细胞（T淋巴细胞和B淋巴细胞）与机体的免疫有极密切的关系，B細胞可转变为浆细胞，抗体主要是由浆细胞合成并分泌到血浆中的。T细胞本身虽不直接产生抗体，但它可与B细胞合作帮助B细胞产生抗体。Zyla等[10]发现添加黑曲霉菌丝体（A.niger FM）使法氏囊重增加，显著减少了肠系膜派尔氏（Peyers）淋巴结。郭晓红等用大豆异黄酮对肉仔鸡生产性能及免疫性能的研究表明异黄酮能够提高抗体水平和T淋巴细胞增殖[11]。该试验发现各试验组均显著提高了B淋巴细胞增殖反应，但随着添加水平的提高有降低B淋巴细胞增殖的趋势，添加0.1%和0.2%的RSF显著提高了T淋巴细胞增殖反应，说明RSF能调节肉仔鸡免疫机能，增强了ConA和LPS对淋巴细胞刺激的反应性，从而提高肉仔鸡免疫力，这与邱荣斌等[12]研究结果相一致。

胸腺产生的胸腺素T细胞成熟的效应因子，可促进合成具有胸腺素依赖的IL2受体，调节IL2在免疫系统中的作用[13]。该试验中高浓度的RSF对肉仔鸡生长初期胸腺指数影响显著，但是随着肉仔鸡的生长，高浓度RSF对肉仔鸡胸腺指数的影响降低，而低浓度RSF对胸腺指数的作用却有所提高，说明高浓度RSF在肉仔鸡生长初期能够促进胸腺素的产生，但是在生长后期反而抑制胸腺素的分泌。

脾脏是鸡体内最大的免疫器官，参与细胞免疫和体液免疫，脾脏重量的提高在某种程度上反映了动物机体的免疫水平[14]。该试验发现0.1%RSF显著提高了49日龄脾脏指数，表明RSF降低死淘率作用原因之一是由于提高了脾脏器官重量，但突出表现在生长后期。0.2%RSF降低了脾脏器官重量，可能是因为其在前期造成的免疫损伤一直持续到生长后期所致。

法氏囊是鸡重要的免疫器官，添加0.1% RSF提高前期成活率，可能与其提高法氏囊指数相关。36日龄和49日龄，各试验组肉仔鸡法氏囊指数无显著差异，这可能与法氏囊随日龄的增长而逐渐萎缩有关。

RSF对肉仔鸡免疫机能有调节作用，0.1%RSF提高了T、B淋巴细胞增殖反应，较对照组分别提高9.1%和8.3%。在生长全期提高了肉仔鸡胸腺指数，较对照组分别提高217%、26.2%和19.1%。在生长后期提高了肉仔鸡脾脏指数，较对照组提高35.9%，说明添加0.1% RSF能增加脾脏器官重，生长后期表现突出。生长前期提高了肉仔鸡法氏囊指数，对照组提高32.0%，生长后期各试验组在法氏囊指数上无显著差异（P>0.05），这与法氏囊随日龄增长逐渐萎缩有关。但随着RSF添加水平的提高，并没有进一步提高肉仔鸡免疫机能，添加0.2%RSF反而降低了49日龄脾脏指数，添加0.3%RSF没有进一步降低反而有所缓和。这可能是因为高剂量异黄酮造成了免疫抑制，而没有进一步降低可能是由于米曲霉菌的调节作用。

42卷36期孟翠红等红三叶草固态发酵物对肉仔公鸡免疫机能的影响

参考文献

[1]

曾分有，周海燕，吴永尧.红三叶草活性成分及其在保健食品和医药中的应用[J].现代生物医学进展，2007（3）：449-450.

[2] 沈玥，张永忠.红三叶草异黄酮抗氧化活性的研究 [J].食品与发酵工业，2009（11）：122-124.

[3] 周振亚.红三叶草总异黄酮提取、分離、纯化工艺研究[D].兰州：兰州大学，2008.

[4] 刘志胜，李里特，辰巳英三.大豆异黄酮及其生理功能研究进展[J].食品工业科技，2000（1）：78-80.

[5] 杨守凤，徐建雄.β葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮及其保健功能的研究进展[J] .饲料研究，2014（1）：6-12.

[6] 陈伟，林映才，马现永，等.饲粮异黄酮添加水平对肥育猪抗氧化、生长及屠体性能的影响[J].动物营养学报，2014（2）：437-444.

[7] 戴述诚，李志业，叶勇，等.新型绿色饲料添加剂——大豆异黄酮[J].中国动物保健，2013（9）：15-18.

[8] 刘志伟，谭兴和，周红丽，等.米曲霉产中性蛋白酶条件的优化[J].中国酿造，2011（11）：103-107.

[9] 马光，郭继平.米曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶饲料条件的优化[J]. 生物技术，2010（6）：81-85.

[10] 程文晓.曲霉菌发酵红三叶草产纤维素酶的研究[D].太谷：山西农业大学，2007.

[11] ZYLA K，LEDOUX D R.The efficacy of enzymic cocktail and a fungal mycelium in dephosphorylating cornsoybean mealbased feeds fed to growing turkeys[J].Poult Sci，1996，75：381-387.

[12] 郭晓红，赵恒寿.大豆黄酮对肉仔鸡生产性能和免疫机能的影响[J].粮食与饲料工业，2004（6）：40-42.

[13] 邱荣斌，吴发兴.不同剂量维生素C对蛋鸡免疫机能的影响[J].动物医学进展，2009（11）：72-75.

[14] PANDEY A，SZAKACS G，SOCCOL C R，et al.Production，purification and properties of microbial phytases[J].Bioresour Technol，2005，77：203-214.