应用实时荧光定量PCR研究BBTV DNA1在香蕉不同组织中的含量

周朋等

摘 要 为准确定量香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）DNA1组分在香蕉组织中的分布和含量，建立以SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR）方法。利用B1-F/B1-R引物扩增海南BBTV DNA1组分并构建到pMD18T sample载体，再以B2-F/B2-R引物测定该质粒的标准曲线，其线性方程为Y=-3.247×LOG（X）+8.01，相关系数r2=0.997，扩增效率为103.2%，标准质粒检测灵敏度约为214 copies/μL。分别选取染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg，提取DNA并进行实时荧光定量PCR检测。结果表明：病株各部位均含BBTV病毒，但含量有明显差异，其中嫩叶（3.08×108 copies/mg）>叶鞘（2.50×108 copies/mg）>假茎（1.29×108 copies/mg）>球茎（1.67×107 copies/mg），呈依次递减。

关键词 香蕉束顶病毒；实时荧光定量PCR；病毒含量

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

Abstract To accurately measure the distribution or amount of Banana bunchy top virus DNA1 component in banana leaf， sheath， pseudostem and corm tissues， the real-time fluorescence quantitative PCR method was used to study in this paper. A 978 bp nucleotide sequence of DNA1 was obtained by B1-F/B1-R primers and ligated to pMD18T sample vector as a plasmid standard. The plasmid standard curve was determined by the real-time fluorescence quantitative PCR by B2-F/B2-R primers with the linear equation Y=-3.247×LOG（X）+8.01， correlation coefficient r2=0.997， and amplification efficiency 103.2%. The minimum detectable amount of the standard plasmid is approximately 214 copies/μL. The infected banana leaves， sheaths， pseudostems and corms of 4 samples were taken for DNA extraction， and real-time quantitative PCR results showed that BBTV virus was existed in these tissues. However， there are significant differences in the amount in leaf（3.08×108 copies/mg）， sheath（2.50×108 copies/mg）， false stem（1.29×108 copies/mg）and corm（1.67×107copies/mg）， presenting in descending order.

Key words BBTV； Real-time fluorescence quantitative PCR； Virus measurement

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.023

香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）属矮化病毒科（Nanoviridae）香蕉束顶病毒属（Babuvirus），是香蕉束顶病（Banana bunchy top disease，BBTD）的病原[1-3]。染病香蕉叶片背部有深绿色条纹，并向叶片中脉延伸，叶片聚束造成植株发育不良，严重影响果实的生长[3]。BBTV为18～20 nm的等径二十面体粒体，基因组至少由6个环状单链DNA组分组成，编码不同的蛋白，DNA1编码复制起始蛋白（Replication initiation proteins，Rep）[4-5]，DNA2编码未知蛋白[6]，DNA3编码外壳蛋白质（Coat protein，CP）[7]，DNA4编码运动蛋白（Movement protein，MP）[8]，DNA5编码Rb-结合蛋白（Rb-binding-like protein）[8]，DNA6编码核穿梭蛋白（Nuclear shuttle protein，NSP）[1， 8]。而DNA 1序列的高度保守性是BBTV分组的标准之一[9]。

近年来，实时荧光定量PCR在病毒方面的研究已成为分子生物学领域的一个热点，特别在病毒、细菌和病原体的定量检测、监测具有独特的优势[10]。与传统PCR相比，荧光定量PCR能实时监控PCR反应的进程并准确定量，灵敏度大约是传统PCR的10～100倍[11]。利用实时荧光定量PCR检测BBTV已多有报道，如Chen等[12]通过Taqman探针法对病株进行了检测，Fu[13]和Watanabe[14]通过SYBR法对病株和媒介分别进行了检测。但利用实时荧光定量PCR检测BBTV在香蕉寄主各组织器官的含量分布未见报道。本研究首先建立了以DNA1为模板、SYBR Green-I荧光染料为标记的实时荧光定量PCR方法，然后对染病香蕉的嫩叶、叶鞘、假茎和球茎BBTV含量进行检测。本研究的染病香蕉BBTV DNA1在各部位定量检测对海南香蕉的生产和病毒病的控制有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 具有典型BBTD症状、经间接酶联免疫法（ID-ELISA）检测为阳性的巴西蕉（Musa spp.）植株，取自海口地区，由本实验室保存备用。

1.1.2 菌株和载体 E.coli Competent cells DH5α和pMD18-T Simple Vector均购自TaKaRa公司。

1.1.3 试剂及仪器 琼脂糖凝胶回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒和植物DNA提取试剂盒均购自TIANGEN公司（中国北京）；Easy Taq DNA Polymerase购自北京全式金技术有限公司；SYBR Premix Ex Taq、PrimeScript Reverse Transcriptase、DNA Marker DL 2000均购自TaKaRa公司；实验所用实时荧光定量PCR仪为Stratagene Mx3005P。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据本实验室报道的BBTV海南分离物DNA1组分（AY494788、HQ378190、HQ616074和FJ463042）保守序列设计2对特异引物B1-F/B1-R和B2-F/B2-R，扩增片段长度分别为978、236 bp。引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

1.2.2 香蕉总DNA的提取 从冰箱中取0.5 g感染BBTV的香蕉嫩叶组织，液氮研磨，取100 mg按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取病样总DNA，溶于50 μL体积水中，于-20 ℃保存备用。

1.2.3 pMD18T-DNA1质粒标准品构建 以病株的总DNA为模板，以B1-F/B1-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×Easy Taq buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板1 μL （20 μg），加ddH2O 11.0 μL至总体积为25 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。将扩增得到的DNA1片段切胶回收，连接至pMD18-T Simple载体上，最后选取3个克隆子送往生工测序部测序。对测序正确的阳性克隆菌提取质粒，溶于50 μL ddH2O中，稀释100倍后用Thermo Nanodrop 2000测定pMD18T-DNA1浓度并进行拷贝数换算[拷贝数=（50×A×n）/B×6.02×1014，其中A代表吸光度值，n代表稀释倍数，B代表质粒分子量]。

1.2.4 实时荧光定量PCR预实验 分别以pMD18T-DNA1和病株总DNA为模板，以B2-F/B2-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系参照1.2.3。反应程序为：95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；降至16 ℃反应结束。

1.2.5 标准曲线的建立 将质粒标准品以10的梯度倍数稀释9个梯度（共10个梯度），并以此作为模板，进行实时定量PCR反应，反应体系为：SYBR Premix EXTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5 μL，引物B2-F/B2-R各0.5 μL，梯度稀释的质粒标准品模板1 μL，加ddH2O 10.0 μL至总体积为25 μL。反应程序参照1.2.4。反应结束后，实时荧光定量PCR仪（Stratagene Mx3005P）根据结果自动生成标准曲线。

1.2.6 实时荧光定量PCR与普通PCR的灵敏度比较 另一组也以同样梯度稀释的质粒标准品为模板，反应体系同1.2.5，反应程序按照1.2.4，进行普通PCR检测。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 BBTV含量的测定 以本实验室保存的4棵香蕉病株为材料，分别取其嫩叶、叶鞘、假茎和球茎各100 mg，共16个样品，按照植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，溶于50 μL H2O中，反应体系同1.2.5，反应程序按照1.2.4，进行实时荧光定量PCR检测。

2 结果与分析

2.1 总DNA的提取

取5 μL总DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳，结果显示：条带清晰，无明显弥散带，可作为模板用于后续的PCR扩增。

2.2 标准质粒构建

测序结果表明，3个阳性克隆子序列一致，均来自BBTV DNA1序列。经NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST分析结果表明，本实验扩增获得的DNA1序列与GenBank公布的BBTV Haikou-4 DNA1序列（HQ378194）同源性最高，达到99.28%。提取质粒，稀释100倍后经Thermo Nanodrop 2000测得OD280为0.017，计算得出标准质粒浓度为2.14×109 copies/μL。

2.3 引物验证

采用引物B2-F/B2-R扩增标准质粒pMD18T-DNA1和病株总DNA，结果均得到一条大小约236 bp的单一条带，无非特异性扩增、无二聚体，健康香蕉总DNA和水空白均无扩增条带（图1）。

2.4 实时荧光定量PCR标准曲线

实时荧光定量PCR仪（Stratagene Mx3005P）生成的标准曲线的线性方程为Y=-3.247×LOG（X）+8.01，标准曲线的扩增效率（E）为103.2%，拷贝数对数与Ct值之间的相关系数（r2）为0.997，该标准曲线完全可满足实验的可信度要求，如图2所示。目的片段TM值为86 ℃（图3），溶解曲线为单一峰，特异性强。

2.5 实时荧光定量PCR灵敏度检测

应用实时荧光定量PCR方法检测BBTV DNA1，PCR反应为35个循环时，可检测到标准质粒灵敏度为10-7，即样品浓度为2.14×102 copies/μL（图4）。而普通PCR检测的灵敏度是10-5，即2.14×104 copies/μL（图5）。此结果表明实时荧光定量PCR检测BBTV DNA1的灵敏度是普通PCR的100倍左右。

2.6 BBTV含量的测定

实时荧光定量PCR结果表明，4棵病株各部位均含BBTV，但含量有明显差异。对4个样品的Ct值换成拷贝数后，取平均值，其中，嫩叶（3.08×108 copies/mg）>叶鞘（2.50×108 copies/mg）>假茎（1.29×108 copies/mg）>球茎（1.67×107 copies/mg），呈依次递减（图6）。球茎的标准差较小，表明BBTV在该部位含量波动较小；而嫩叶、叶鞘和假茎的标准差大，说明BBTV在嫩叶、叶鞘和假茎的个体差异大。

3 讨论与结论

本研究结果表明，病株各组织均含有BBTV病毒，但含量有明显差异，其中嫩叶最高，叶鞘次之，假茎第三，球茎最低。趋势与赖星华等[15]的探针法和范国成等[16]的抗体结合法检测结果基本吻合。BBTV侵染香蕉形成侵染点后会向植株的其他部分转移，形成系统感染，最终使香蕉植株矮缩、束顶，无果或果实变小。病毒在香蕉各组织中的含量与很多因素有关，如寄主的基因、病毒的基因、寄主的防御机制、从侵染点到植株其部分的维管束和环境条件等。这些或者其它的因素最终使病毒在植株各组织的分布不均。

BBTV为多组分ssDNA病毒，各组分表达的不同蛋白行使着不同的生物学功能。其中DNA1表达的复制酶基因是病毒复制的必需组分，其表达量的高低可能决定病毒颗粒的多少。相对于其它植物病原微生物，植物病毒的核酸序列具有简单、重复和长度短等特点。BBTV除DNA2组分外，其它5个组分均比较保守，其中又以DNA1保守性最好。以此为依据，本研究在BBTV DNA1组分的高度保守区域设计特异引物，针对性强、特异性高。荧光染料实时定量PCR方法所用的引物必须高度特异，无二聚体。引物验证结果表明，本实验前期所设计的5对引物中筛选出了最优的1对引物，即B2-F/B2-R。

用于本研究的4棵香蕉病株在不同香蕉大田中选取，其水肥环境和感染病毒的早晚可能不一致，所以各株间同一组织的病毒含量也有差异。其中叶鞘的差异最大，球茎差异最小，但各株总体分布趋势趋于一致，使结果更具有代表性。本研究建立的方法与DNA探针法和抗体方法相比，其优点在于能定量检测BBTV在染病香蕉各组织的含量，且灵敏度高、特异性强，也可用于检测组培苗和交脉蚜等病毒含量较低的材料。

参考文献

[1] 余乃通， 冯团诚， 王健华，等. 香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白（NSP）的纯化及抗血清制备[J]. 基因组学与应用生物学， 2010， 29（2）： 375-378.

[2] 冯团诚， 王健华， 刘志昕，等. 香蕉束顶病毒海口分离物基因组的克隆及序列分析[J]. 植物病理学报， 2010， 40（1）： 40-50.

[3] 余乃通， 刘志昕. 香蕉束顶病毒研究新进展[J]. 微生物学通报，2011，38（3）：396-404.

[4]余乃通，张雨良，王健华，等. BBTV Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立[J]. 中国农业科技导报， 2011， 13（2）：31-37.

[5] 余乃通， 王健华， 张雨良， 等. 香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达及抗血清制备[J]. 植物保护， 2011， 37（4）： 38-43.

[6] Yu N T， Zhang Y L， Wang J H， et al. Cloning and sequence analysis of two Banana bunchy top virus genomes in Hainan[J]. Virus Gene， 2012， 44（3）： 488-494.

[7] 余乃通， 冯团诚， 王健华， 等. 香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备[J]. 热带作物学报，2010， 31（5）： 767-771.

[8] Wanitchakorn R， Hafner G J， Harding R M， et al. Functional analysis of proteins encoded by banana bunchy top virus DNA-4 to-6[J]. J Gen Virol， 2000， 81（1）： 299-306.

[9] Karan M， Harding R M， Dale J L. Evidence for two groups of banana bunchy top virus isolates[J]. J Gen Virol， 1994， 75 （12）： 3 541-3 546.

[10] 陈 旭， 齐凤坤， 康立功，等. 实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 东北农业大学学报， 2010， 41（8）： 148-155.

[11] 赵焕英，包金风. 实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志， 2007， 16（4）： 492-497.

[12] Chen Y， Hu X. High-throughput detection of banana bunchy top virus in banana plants and aphids using real-time TaqMan（R）PCR[J]. J Virol Methods， 2013， 193（1）： 177-183.

[13] Fu H C， Hu J M， Hung T H， et al. Unusual events involved in Banana bunchy top virus strain evolution[J]. Phytopathology，2009， 99（7）： 812-822.

[14] Watanabe S， Greenwell A M， Bressan A. Localization， concentration， and transmission efficiency of Banana bunchy top virus in four asexual lineages of Pentalonia aphids[J]. Viruses，2013， 5（2）： 758-776

[15] 赖星华， Robert R M， Dale J L. DNA探针诊断和追踪香蕉束顶病毒研究[J]. 西南农业学报， 1991， 4（4）： 76-79.

[16] 范国成， 陈菁瑛， 周乐峰，等. 应用酶联免疫吸附测定技术检测香蕉束顶病毒[J]. 福建农业学报， 1999， 14（1）： 19-22.