22份余甘子核心种质资源遗传多样性的SRAP分析

郭林榕等

摘 要 利用SRAP标记检测资源圃中保存的代表南方湿润分布区（福建、广东、广西）的22份余甘子种质材料遗传多样性。结果表明：8对SRAP引物组合共产生167条扩增带， 其中135条为多态性条带。多态性条带比率为68.8%～90.0%， 平均为80.8%。分析计算余甘子种质间的遗传相似度（GS），22份材料GS的范围为0.641～0.964。UPGMA法聚类分析结果表明，22份种质可分为两大类，其中福建地区15份余甘子间的遗传相似系数为0.641～0.964， 广东地区5份余甘子的遗传相似系数为0.707～0.952。此研究结果表明，余甘子基因型具有丰富的遗传多样性，SRAP技术可有效运用于余甘子资源的遗传多样性分析。

关键词 余甘子；SRAP；种质；遗传多样性

中图分类号 S667.9 文献标识码 A

Abstract Twenty-two Phyllanthus emblica germlasms collected from humid regions of Southern China（Fujian， Guangdong and Guangxi） were used to analyze their genetic diversity. 167 bands were amplified by 8 selected primer combinations， in which 135 bands were polymorphic. The percentage of polymorphic fragments was 68.8%-90.0%， and 80.8% in average. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 among these germlasms. Using unweighted pair-group method with arithmetic means（UPGMA） cluster analysis on the SRAP markers， the germlasms could be divided into two groups. The genetic similarity coefficients were ranged from 0.641 to 0.964 from 15 Fujian germlasms， and 0.707-0.952 from 5 Guangdong germlasms. All results suggested that SRAP markers were suitable for the research of the genetic diversity on ryegrass.

Key words Phyllanthus emblica；SRAP；Germplasm；Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.022

余甘子（Phyllanthus emblica L.）为大戟科叶下珠属植物，汉杨孚《异物志》中即有记载，为原产中国的珍稀果树，是药食同源的优良树种[1-9]。因其抗性强、耐旱耐贫脊，对红壤、黄壤、砂壤等多种土壤适应性较强，现主要分布于福建、云南、广西、广东、贵州、台湾、海南、四川等热区省份。中国拥有大面积的野生资源群落，野生种、农家种、栽培品种（系）栽培历史约有2 000 a，时间长、分布广，造成余甘子种质之间同名异物、同物异名现象的广普性。只有阐明余甘子种质间基因的亲缘关系，才能为种质的分类，遗传育种和种质资源保存提供有力证据。福建省农科院果树所依托省科技厅重点项目、国家科技基础条件平台项目，在2008年建立了国内首个余甘子种质资源圃，开展余甘子种质资源的鉴定、评价及资源的标准化整理、整合工作。研究中引入SRAP分子标记技术，分析收集、保存的余甘子种质资源，拟建立品种特异性的标准DNA指纹图谱，进行遗传多态性、系统发育与演化等方面的研究，为余甘子种质资源的准确鉴别及相互间亲缘关系分析提供科了科学依据。

SRAP（Sequence Related Amplified Polymor phism）是2001年首先由美国加州大学蔬菜作物系Li等[10]报道的新的分子标记技术，分别由独特设计的17、l8个碱基组成的上、下游引物优先对基因组DNA开放阅读框、内含子和启动子区域进行特异扩增，因不同基因型启动子、内含子和间隔序列长度不同而产生多态性。其扩增多态性高，所能提供的生物学信息更多，检测的结果更能反映物种遗传多样性和亲缘关系。目前此技术已成功应用于柿、枇杷、桃[11-15]等果树遗传多样性的研究。瞿文林等[16]从数量性状上分析余甘子天然居群果实形态变异；赵琼玲等[17]采用聚类、主成分分析等方法，分析了14份云南不同种源余甘子植物形态变异的特征规律。目前对余甘子的研究，尚缺乏较系统、有针对性地对不同产地的余甘子资源进行分子水平上的遗传评价与鉴定分类。因此通过形态学评价，选择具代表性的22份余甘子种质资源为材料，在前期体系优化的基础上[18]，利用SRAP分子标记技术研究余甘子资源的遗传多样性，可为余甘子种质资源的分类和育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 余甘子试材取自福建省农业科学院果树研究所余甘子种质资源圃。于2012年春季采集各品种（系）幼嫩叶片，保存于-80 ℃冰箱中备用。共选取22份余甘子种质，其生物学性状详见表1。

1.1.2 试剂和仪器 SRAP-PCR所用Mg2+、 dNTPs、Taq DNA聚合酶、标准分子量DNA（DL2000）购自宝生物工程（大连）有限公司，SRAP引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，电泳所用主要试剂甲酰胺、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺、尿素、TBE电泳液均为国产分析纯。

1.2 方法

采用改良CTAB法提取基因组DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，以紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，并将浓度稀释至50 ng/mL。选取已公布的SRAP上下游引物各8条，组成64对引物组合，筛选出扩增多态性好、条带清晰的引物，对22份材料进行扩增，扩增条件参照Pinmai等[6]的方法。

1.3 统计分析

选取引物在相同基因位点扩增清晰的条带，根据条带的有无分别记做“0”和“1”。不同引物扩增的结果构成原始的“0，1”二元数据矩阵，利用NTsys 2.10e分析软件计算余甘子种质间的遗传相似度（GS），采用UPGMA法构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

从64对引物组合中筛选出8对扩增带清晰、重复性好的引物组合，分别对22份材料的DNA进行PCR扩增， 结果每对引物均能扩增出10条以上清晰的条带， 最多能扩增出26条条带。8对引物共产生167条扩增带（表2），其中135条为多态性带， 平均每对引物产生20.8条扩增带、16.9条多态性带。多态性带比率为68.8%～90.0%， 平均为80.8%。

2.2 聚类分析

2.2.1 遗传相似性分析 应用NTsys软件，根据上述167个位点谱带0，1数据为原始矩阵，计算22个供试材料两两种质间的遗传相似系数。结果表明， 22份材料GS的范围为0.641～0.964（表3）。其中福建地区15份余甘子间的遗传相似系数为0.641～0.964，广东地区5份余甘子的遗传相似系数为0.707～0.952。其中收集自福建的“玻璃甘”和广东的“玻璃甘”同名，但二者遗传相似系数为0.737，遗传差异较大，且果形等生物学性状表现明显不同，应为同名异物。

2.2.2 聚类结果分析 采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析，结果见图1。本研究的22份余甘子材料可划分为两大类群，A类群包含了本次实验所选取的6份广东地区的余甘种质和10份福建地区的余甘种质，B类群包含了2份广西地区的余甘子和4份福建地区余甘子。其中在相似系数为0.74处，A类群中的16份余甘子可进一步细分成3个小群：A1小群均为福建省地方种质，包含蓝丰、六月白、粉甘、枣甘、扁甘、玻璃甘（闽）、南安2号及收集到的野生资源共10份；A2小群均为广东省地方种质，包含甜种、饼甘、狮头等4份；A3小群较小，只包含广东地区的2个种质。

3 讨论与结论

余甘子的分类传统上是依据生物学特性和主要农艺性状进行归类。根据不同的成熟期，划分为极早熟、早熟、中熟、晚熟、一年多熟品种。此外还有以果形、果重、果实风味等划分方法。但形态学分类容易受环境因素的影响，特别是余甘子作为新兴的栽培果树，由于不同分布区环境条件的差异，各地驯化栽培的农家品种的各种性状包括树体性状、花果性状、物候期等在不同地域表现变异大，需要更为客观的鉴定手段。现阶段一般采用分子标记方法鉴定种质差别、分析遗传多样性，从DNA水平上反映各个基因型之间的内在差异，对余甘子资源的整理分析亦可使用分子生物学方法。

已有学者尝试使用RAPD对余甘子进行遗传多样性分析，蔡英卿等[19]采用20个具特异扩增的多态性引物对福建省34份余甘子基因型进行扩增，20条引物在34份供试材料中总共扩增出259个位点，多态性程度100%，采用ED（欧氏距离）法进行RAPD标记的聚类分析则可将福建34份余甘子遗传资源明显划分为惠安余甘和莆田余甘两大类，两类群余甘子资源遗传背景复杂，遗传分化程度大。刘晓生等[20]对广东潮汕地区所收集的17份余甘子资源进行分析，指出17份种质的遗传相似系数为0.5714～0.9，表现出了较高的遗传多样性。而本研究取材范围进一步扩大，选取了代表余甘子南方湿润分布区的福建、广东、广西部分种质开展了遗传多样性的分析。所采用的8个引物组合在22份供试材料中总共扩增出167条谱带（个位点），多态性比率达80.8%；各供试材料之问的遗传相似度为0.641～0.964。从前人已发表文献及本研究结果可以看出：福建、广东余甘子栽培种质遗传多样性均处于较高水平。这体现出余甘子农家栽培品种栽培驯化时间短、驯化起源多的特征。本研究尝试分析的闽粤黔3省的22份余甘子种质可分为两大类群，其中A类群包括了多数的福建和所有的广东余甘子品种，B类群包括了少数福建和广西的余甘子品种，聚类的结果与资源地理划分并不一致，这可能是因为地理位置相近，这3个地区的种质历史曾发生交流。此外分析所得的聚类结果也与果型表现没有明显的对应关系。由于余甘子分布地域较广、适应性强，在不同的生态环境下必然表现出适应当地环境的形态特征，果实性状是农户参考辨识品种的依据之一，但由于余甘子种质收集工作起步较晚，所收集品种多数来源于民间，农家品种的命名相对杂乱，存在误判的可能，这也有可能干扰到聚类结果的准确性。综上所述，SRAP聚类结果既显示出一定的地理来源相关性，又存在差别。而农艺性状的表现受外界环境影响大，笔者认为在特定区域内可使用农艺性状辨识相近的余甘子种质资源，但类似的性状并不代表相近的遗传背景。

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