拟南芥AtGDPD—like6和AtGDPD—like7基因突变体鉴定

王志凤　程玉祥　李淑娟

摘要[目的]鉴定拟南芥AtGDPD-like6和AtGDPD-like7基因的突变体。[方法]以拟南芥AtGDPD-like6和AtGDPD-like7为研究对象，采用半定量RT-PCR法进行分析，并用3引物PCR扩增法进行筛选和鉴定。[结果]各得到2个AtGDPD-like6和AtGDPD-like67独立T-DNA插入纯合突变体。半定量RT-PCR结果显示，4个纯合突变体中目标基因转录表达都被完全敲除。[结论]AtGDPD-like6和AtGDPD-like67突变体材料的获得为生理功能的鉴定提供了反向遗传学材料。

关键词 拟南芥；AtGDPD-like6；AtGDPD-like7；T-DNA；突变体鉴定

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01921-02

基金项目国家高技术研究发展计划（2013AA102702）。

作者简介王志凤（1988-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：林木遗传育种。*通讯作者，高级工程师，从事林木分子遗传改良、林木基因工程育种。

收稿日期20140120甘油磷酸二酯磷酸二酯酶GDPD（glycerophosphodiester phosphodiesterase）广泛地存在于原核和真核生物中，最早在大肠杆菌中被发现，有2个成员：glpQ和ugpQ，参与细菌的碳、磷营养代谢[1-2]。酵母GDPD（GDE1）水解产生的肌醇、胆碱等是其重要的代谢物质[3-4]。哺乳动物GDPD家族成员生理功能被报道较多，例如：GDE1/MIR16在磷酸肌醇代谢和G蛋白信号转导之间起桥梁作用[5]；GDE2参与调解脊髓运动神经元的分化[6]；GDE6则促进了骨细胞分化[7]。植物GDPD活性在胡萝卜悬浮细胞的细胞壁和液泡中被最先报道[8]，该活性还受低磷环境刺激[9]。

拟南芥有13个含GDPD结构域的基因，分为GDPD和GDPDlike 2个亚家族，且GDPDlike亚族基因是植物界（含藻类）所特有的[10]。此外，根毛发育障碍、侧根较少的shv3突变体是由AtGDPDlike3突变所致[11]。目前，关于植物GDPDlike的功能研究鲜有报道。Wang等的转录组数据提示，2个同源基因AtGDPDlike6和AtGDPDlike7可能参与拟南芥花粉萌发和花粉管伸长[12]。笔者对AtGDPDlike6和AtGDPDlike7组织表达模式进行鉴定，并筛选出其TDNA插入突变体，以期为下一步研究这2个基因功能奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1 研究对象。拟南芥材料均为Columbia型，TDNA插入株系为SALK_037722C、SALK_121181、SALK_057184C和CS801992，均购自ABRC Ohio State University。

1.1.2 主要试剂。植物基因组DNA快速提取试剂盒，购自百泰克公司；pBIOZOL Reagent，购自BioFlux公司；Silica Bead DNA Gel Extraction，购自KitFermentas公司；pMD18T载体、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit With gDNA反转录试剂盒，均购自TaKaRa公司；引物，由Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1 植物基因组DNA提取。操作过程参照试剂盒说明书。

1.2.2 植物总RNA提取及cDNA合成。取植物材料，经过液氮速冻、研碎至粉末，用4 ℃预冷的pBIOZOL试剂悬浮粉末后移入1.5 ml离心管，具体步骤参照pBIOZOL Reagent说明书。总cDNA合成使用Primescript RT reagent Kit with gDNA eraser试剂盒。