锯叶棕苗期叶斑病菌（Calonectria pteridis）生物学特性及其对11种杀菌剂的毒力反应

郑丽等

摘 要 对锯叶棕苗期叶斑病病原菌（Calonectria pteridis）的生物学特性进行初步研究，结果表明：该病原菌菌丝生长适宜温度范围为28～30 ℃，适宜生长pH范围为5.0～6.0；分生孢子萌发最适温度为28 ℃，最适pH为5.5。菌丝对碳源的利用效果由高到低依次为D-木糖、D-果糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-麦芽糖和肌醇；对氮源的利用效率以草酸铵最高，明显优于其他氮源，而分生孢子的萌发受不同碳、氮源的影响较小。在室内采用菌丝生长速率法，测定11种杀菌剂对菌丝生长的抑制作用，结果表明：50%多菌灵和70%甲基托布津的EC50值最小，分别为0.486 4和2.958 9 mg/L；而80%代森锌和15%三唑酮的EC50值最大，分别为130.160 3和159.737 9 mg/L，抑菌效果最差。

关键词 锯叶棕；叶斑病；生物学特性；杀菌剂筛选

中图分类号 S436.421.1 文献标识码 A

Biological Characteristics and Screening of Fungicides of

the Pathogen Fungi of Saw Palmetto Leaf Spot in

the Seeding Stage

ZHENG Li1， YANG Wei3， QIN Xindao1， TIAN Wanying4， LI Jing1， XIE Changping2 *

1 Guangzhou Experimental Station / Tropical Energy and Ecology Research Centre， Chinese Academy of Tropical

Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510140， China

2 College of Environment and Plant Protection， HainanUniversity， Haikou， Hainan 570228， China

3 School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300， China

4 Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Biological characters of Calonectria pteridis which causes leaf spot on Saw Palmetto were determined in the study. The results indicated that the optimal temperature for mycelium growth was 28-30 ℃， and the optimal pH was 5.0-6.0. The optimal temperature for conidium germination was 28 ℃， and the optimal pH was 5.5. The order of carbon sources utilization against C. pteridis was： D-xylose， D-fructose， D-glucose， D-sorbitol， D-lactose， D-maltose and inositol， while the ammonium oxalate was the best nitrogen source for mycelium growth. But there is no significant impact of carbon source and nitrogen source on conidium germination. Inhibition activity of 11 common fungicides against C. pteridis was also detected. According to the results， the best inhibition activities were gained by 50% carbendazim and 70% thiophanate-methyl while their EC50 values was 0.4864 and 2.958 9 mg/L， respectively. In contrast 80% zineb WP and 15% triadimefon EC was 130.160 3 and 159.737 9 mg/L， which showed the worst inhibition activities to the pathogen.

Key words Saw palmetto； Leaf spot disease of Calonectria pteridis； Biological characteristics； Screening of Fungicides

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.030

锯叶棕[Serenoa repens（Bartr.）J. K. Small]，属棕榈科（Palmae Juss.）锯叶棕属（Serenoa Hook.F.），是锯叶棕属唯一代表植物，是一种重要的药用棕榈植物，同时也可作为观赏植物，供庭院种植[1]。据《美国药典》和《英国药典》记载，其果实内的提取物具有抗菌消炎、祛痰平喘、镇静、解痉、调节内分泌、促进泌乳、利尿、促进食欲以及抗肿瘤之效，可治疗50多种疾病，是美国最畅销的十大植物药物之一[2]，也是最有效的治疗良性前列腺肥大症状（Benign Prostatic Hyperplasia，BPH）的植物药物之一[3]，在全球的销售总额仅次于人参和银杏[1，4]。

中国海南省的气候条件适合锯叶棕生长。在2003年12月和2004年4月，广西亚热带作物研究所与美国加州湾食品科技公司合作， 先后引进锯叶棕种子2.4万粒，进行引种、试种适应性观测。近年来，在中国海南省儋州劲芳种植基地和私人农场，均有引种、栽培[5]。

国内外对锯叶棕病害报道较少，常见病害有心腐病，根腐病和炭疽病[6]。笔者2010年在海南儋州市某锯叶棕苗圃病害的调查中，发现苗期叶片上出现一种由蕨氏丽赤壳菌（Calonectria pteridis）引起的叶斑病[7]，危害严重时，整株叶片脱落。现在病原菌鉴定的基础上，对其进行了生物学特性研究和室内药剂筛选，为叶斑病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌 实验室保存的蕨氏丽赤壳菌（Calonectria pteridis Wolf）。

1.1.2 试剂和药品 各种生理生化试剂均为国产分析纯，实验供试药剂见表1。

1.1.3 仪器和设备 DHZ-DA摇床（太仓市仪器设备厂）；GXZ培养箱（宁波江南仪器制造厂）；SMZ-140解剖镜（Motic）；PHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）；SW-CJ-1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌生物学特性的测定

（1）光照对菌丝生长的影响。用灭菌打孔器在PDA培养基上培养4～5 d的菌落边缘打孔，将菌块接种到PDA培养基平板中央，设置完全黑暗，完全光照，光暗交替（各12 h）3个处理，放置在28 ℃全光照（3 000 Lux）恒温培养箱中培养4 d，第5天测量菌落直径，每个处理重复3次，同时观察产孢情况。

（2）温度对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。对菌丝生长影响：将菌丝块接种到PDA平板中央，分别置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的全光照（3 000 Lux）恒温培养箱中培养，观察菌丝生长情况，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。

对分生孢子萌发影响：从纯化菌落表面挑取分生孢子，用无菌水配成孢子悬浮液，然后在低倍镜（10×10）下检查孢子数，用无菌水调节孢子数，至20～25个孢子/视野。

在经高压灭菌的载玻片上均匀涂上用无菌水稀释过的PDA培养基，待培养基凝固后，将2滴调节好孢子数量的分生孢子悬浮液涂在培养基上，并使其均匀分布，然后将其放入垫有湿滤纸的培养皿内，倒置，分别置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的全光照恒温培养箱中培养3.5 h，取出用0.1 mg/mL升汞固定以后，用显微镜在10倍镜下检查分生孢子的萌发情况，随机选100个孢子检测其萌发率，每个处理3重复。

（3）pH对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。制作好PDA培养基，用无菌的0.1 mol/L的HCl和NaOH将pH调节到4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，高温灭菌（121 ℃，20 min），冷却后，再用无菌的0.1 mol/L的HCl和NaOH重新调节pH值后倒入已灭菌的培养皿中制成平板。

用（2）的方法，接种病原菌到不同pH的培养基平板中央，测定不同pH对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。置于28 ℃全光照（3 000 lx）恒温培养箱中培养，每个处理重复3次。

（4）碳源、氮源对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。选用Richard培养基作为基础培养基[8]，用等碳当量的碳源，分别为D-葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麦芽糖和肌醇依次置换Richard培养基中的蔗糖，配制不同碳源的培养基，不加任何碳源的Richard培养基作为对照。用等氮当量的氮源，分别为硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵和草酸铵依次置换Richard培养基中的硝酸钾，配制成不同氮源的培养基，不加氮源的Richard培养基作为对照。将直径为4.5 mm的菌丝块接种在不同碳、氮源的Richard培养基平板的中央，重复3次，在28 ℃的全光照（3 000 lx）恒温培养箱中培养5 d，第6 天观察菌丝的生长和产孢的情况。

用（2）的方法，测定不同碳、氮源对菌丝生长和分生孢子萌发的影响。

1.2.2 室内药剂筛选 采用菌丝生长速率法测定抑菌效果[8]。将每种供试药剂加入灭菌后冷却至40～45 ℃的培养基中分别制成平板，根据预设结果，将每种药剂设置5个浓度处理，接种单个菌饼（Ф0=0.45 mm），设灭菌水对照，每个处理及对照重复3次。置于28 ℃全光照恒温培养箱中培养5 d后检查各处理中菌株的生长情况。十字交叉测量菌落直径，计算生长抑制率。

抑制率=×100/%

Ф代表抑菌圈直径。

计算浓度对数（X）与抑制菌落生长百分率的几率值（Y），利用最小二乘法分别求得各药剂对该菌的毒力回归方程（Y=a+bX）、EC50和r。

1.2.3 数据分析 在Microsoft Excel中对平板抑菌圈、孢子萌发等数据，进行基本处理后，用SPSS（Version 16.0）通用线性模型中的Duncan's Test（p=0.05），One-Way ANOVA Analysis进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生物学特性分析

2.1.1 光照对菌丝生长的影响 在不同的光照条件下，病原菌菌丝生长差异不大。在24 h完全光照和12 h光暗交替条件下，菌丝的色素颜色较24 h完全黑暗处理的浅；3个不同处理均产生菌核，但24 h完全黑暗处理产生的菌核量少于其它2个处理，各处理间无显著差异（表2）。

2.1.2 温度对菌丝生长和分生孢子萌发的影响

菌丝在15～35 ℃范围内均能生长；在15～30 ℃范围内，菌落直径随温度升高而逐渐增大，30 ℃时菌落直径最大；在15 ℃时菌丝生长缓慢；低于10 ℃或者高于40 ℃，菌丝均不能生长（图1）。不同温度条件下，分生孢子的萌发率不同；10 ℃以下孢子不萌发；在15～35 ℃的范围内，孢子均能萌发，并且在15～28 ℃的温度范围，分生孢子萌发率随温度的上升而升高，在30～40 ℃的温度范围，分生孢子的萌发率随温度的上升而降低；40 ℃时孢子不萌发（图1）。可见，病原菌分生孢子萌发适宜的温度范围是25～30 ℃，最适宜的温度是28 ℃。

2.1.3 pH对菌丝生长的影响 pH4.0～11.0时病原菌的菌丝均能生长，但生长情况各不相同；pH4.0～5.5时菌落直径呈上升趋势，pH 6.0～11.0时呈下降趋势（图2）。适宜菌丝生长的pH范围4.0～6.0。

pH4.0～11.0时病原菌分生孢子的萌发率不同；在pH4.0～6.0之间，分生孢子的萌发率随pH的上升而升高；而在pH7.0～11.0之间，分生孢子萌发率随pH的上升而降低（图2）。病原菌孢子萌发最适宜的pH为5.5。

2.1.4 碳源、氮源对菌丝生长和分生孢子萌发的影响

同的碳源对菌丝生长的影响有所不同；在D-果糖、D-木糖中，菌落的直径明显大于其他碳源，D-果糖和D-木糖菌落大小与对照差异不大，但是从菌落性状来看，D-果糖中的菌丝致密，气生菌丝发达；D-木糖的菌丝稀疏，气生菌丝发达；而对照的菌丝薄而稀疏，气生菌丝极不发达（表3）。在不同的碳源下，分生孢子的萌发率不同；以蔗糖为碳源，孢子的萌发率明显高于其他碳源，但与对照相比无明显差异；其他的碳源中孢子的萌发率都明显低于对照，以葡萄糖为碳源的分生孢子萌发率最低（表3）。

不同氮源对菌丝生长的影响有所不同，6种氮源中以草酸铵作为氮源时菌落直径最大，明显优于其他氮源和对照，并且草酸铵中的菌落菌丝致密，可见草酸铵作为氮源比较有利于菌丝的生长（表4）。不同的氮源对分生孢子的萌发率影响不同，其中氯化铵为氮源的分生孢子萌发率显著低于其他种类氮源，而以硝酸钠、硝酸钾和硝酸铵为氮源，其孢子萌发率差异不显著，但孢子萌发率高于其他氮源和对照（表4）。

2.2 药剂毒力筛选结果分析

2.2.1 供试药剂EC50值比较分析

根据EC50值，11种药剂可分为4个类：EC50小于3.0 mg/L的多菌灵和甲基托布津均为苯并咪唑类杀菌剂 ，其抑菌效果最好；EC50介于5.00～31 mg/L之间的敌力脱、百菌清、腈菌唑和世迪分别属于三唑类、取代苯类，抑菌效果依次降低；EC50在31～39 mg/L之间的拉尔米、醚菌酯和代森锰锌分别属于二硫代氨基甲酸衍生物、甲氧基丙烯酸酯类，EC50值较大，抑菌效果一般；EC50介于130～160 mg/L的代森锌和三唑酮分别属于二硫代氨基甲酸衍生物和三唑类，抑菌效果最差（表5）。

2.2.2 病菌对杀菌剂敏感性比较 对试验结果进行相关回归分析，得到每种杀菌剂的回归方程和斜率，回归方程斜率与病原菌对杀菌剂的敏感性成正比（表5）。按回归方程斜率，供试药剂可分为4类：多菌灵和甲基托布津斜率分别为2.967 8和2.875 0，是供试药剂中斜率最大的，说明病原菌对苯并咪唑类药剂敏感性很高；醚菌酯和代森锰锌斜率分别为2.562 0和2.071 6，斜率较大，说明病原菌对它们的敏感性也较高；拉尔米和三唑酮的回归方程斜率在1.569 5～1.355 3，斜率较小，病原菌对它们的敏感性较低；百菌清、代森锌、腈菌唑、敌力脱和世迪，斜率在0.618 2～0.984 4，斜率很小，说明病原菌对它们的敏感性很低（表5）。

2.2.3 供试药剂抑菌效果综合分析

（1）苯并咪唑类。毒力回归曲线的斜率与病原菌对杀菌剂的敏感性呈正比，因此可以配合EC50值来比较分析药剂的抑菌效果，杀菌剂EC50值越小，毒力回归方程斜率越大，说明随着药剂浓度的增加，对病原菌生长抑制作用提高越快。在11种药剂中，多菌灵和甲基托布津2种苯并咪唑类药剂的斜率值很接近，但其EC50值分别为0.834 8和2.958 9 mg/L，经差异显著性分析，在0.05水平差异达到显著。因此，可认为前者抑菌效果优于后者。

（2）三唑类。在4种三唑类药剂中，敌力脱、腈菌唑、世迪、三唑酮，EC50值分别为5.691 8，15.725 6，

30.671 1，159.737 9 mg/L，而其毒力回归方程斜率依次为0.776 8，0.796 6，0.618 2，1.355 3，差异显著性分析显示，腈菌唑和世迪间差异不显著，敌力脱和它们的差异达到显著，而这3种杀菌剂与三唑酮之间差异却达到极显著。因此，综合分析，敌力脱效果最好，腈菌唑和世迪居中，三唑酮抑菌活性则最低。

（3）二硫代氨基甲酸衍生物及取代苯类。二硫代氨基甲酸衍生物（拉尔米、代森锰锌、代森锌）和取代苯类（百菌清）的EC50值分别为31.485 4，38.843 9，

130.160 3，12.212 2 mg/L，其斜率依次为1.569 5，

2.071 6，0.896 6，0.984 4，显著性分析结果显示，这4种药剂之间差异达到极显著。综合分析，拉而米和百菌清抑菌效果应最好，代森锰锌斜率值较大，但其EC50值亦较大，说明病原菌对其的敏感性较高，有一定的使用价值，并且它们和具有内吸性的苯并咪唑类和三唑类药剂之间的差异达到极显著，可以考虑混配使用。

（4）其他。醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其EC50值为36.439 8 mg/L，而斜率为2.562 0，抑菌效果也很好。

3 讨论与结论

对蕨氏丽赤壳菌（Calonectria peridis Wolf）的生物学特性的研究结果表明，菌丝适宜生长的温度范围是25～30 ℃，分生孢子萌发的最适温度为28 ℃；笔者在田间调查时发现：植株种植密度较高，地势低洼，排水不良的土地上锯叶棕叶斑病发病较重，说明该病菌喜高温高湿。并且该病害在海南6～11月发病率较高，平均发病率高达80%～90%。菌丝生长和分生孢子萌发的适宜pH为5.5，说明病菌适宜在偏酸环境中生存。防治该病时，要加强栽培管理，注意植株的种植密度，改善通风透光条件，改良土壤，雨季要注意田间排水，不在低洼地种植。

在室内药剂筛选中，综合考虑各种供试药剂对病原菌的EC50和斜率发现，11种药剂以苯并咪唑类的多菌灵和甲基托布津效果最好，三唑酮和代森锌抑菌效果最差。代森锰锌和代森锌属于同一类药剂，抑菌效果却存在明显差别，原因有待进一步探讨。三唑类4种药剂，以敌力脱最好，但其市场价格比较高，适合推广使用的为世迪和腈菌唑，而三唑酮效果最差，可能由于它比较常使用，使得菌株产生了一定的抗药性[9]。这些仅仅是杀菌剂在室内对菌丝体生长抑制情况，可能对菌丝抑制效果药剂存在漏筛现象。在进行田间防效时，还需考虑杀菌剂施用时期，防治成本等诸多因素。杀菌剂的田间药效实验防治与毒力测定的结果可能并不完全一致，需要大田防治试验进一步确认，以筛选出高效杀菌剂交替轮换使用。

据报道，对帚梗柱孢属孢子萌发抑制较好的首选药剂有百菌清、多菌灵、甲基托布津、代森锰锌[10]，与本试验中菌丝生长抑制推荐使用的首选药剂吻合。本实验仅仅对菌丝生长进行药剂筛选，由于此病菌传播方式和越冬方式多为分生孢子和厚垣孢子以及微菌核[11]。因此，化学药剂对病原菌孢子萌发的抑制试验有待进一步研究，可以提高防治效果。

帚梗柱孢菌主要分布于热带、亚热带地区，中国种植棕榈科植物的主要地区比较适合该病菌的生存与为害。生物防治的方法使用也较多，如越橘叶斑病防治采用生防细菌（枯草芽孢杆菌应用最广）[12-13]、植物源物质（银杏外种皮乙醇提取物效果最好）[14]、哈茨木霉菌株（T5菌株）[15]等。建议防治该病时，协调运用农业生物防治方法辅以化学药剂预防病害的发生。

参考文献

[1] 林有润. 观赏棕榈[M]. 哈尔滨： 黑龙江科学技术出版社， 2003.

[2] 王 萍， 马子龙， 刘立云. 锯叶棕的药用价值及市场前景分析[J]. 中国热带农业， 2007（3）： 41.

[3] 蔡亲福. 欧洲治疗BPH的植物药[J]. 中成药， 1997， 19（3）： 47.

[4] 国外药讯. 锯叶棕成为男性前列腺肥大（BPH）用药研究新热点[J]. 齐鲁药事， 2004， 23（2）： 55.

[5] 刘志炎， 张干元， 郭可锦. 海南儋州地区引种北美锯叶棕的环境条件分析[J]. 中国热带农业， 2007（2）： 42-43.

[6] 周全光， 黄锦媛， 黄丽君. 美国锯叶棕的引进与适应性观测[J]. 广西热带农业， 2007（5）： 21-22.

[7] Yang Wei， Zheng Li， Wang Cui， et al. The first report of Calonectria pteridis causing a leaf spot disease on Serenoa Repens in China[J]. Plant disease， 2014， 98（6）： 854.

[8] 孙广宇， 宗兆锋. 植物病理学实验技术[M]. 北京： 中国农业出版社， 2002.

[9] 陈 照， 蒲金基， 张 欣， 等. 杀菌剂对巴西橡胶棒孢霉落叶病菌的室内药剂筛选[J]. 现代农药， 2007， 6（2）： 41-43.

[10] 姜子德， 戚佩坤， 陈永青， 等. 广州地区西洋杜鹃根腐与茎基腐病病原种类鉴定[J]. 云南农业大学学报， 2000， 15（4）： 333-336.

[11] 冯 璐. 越橘型叶斑病的诊断鉴定及防治[D]. 大连： 大连理工大学， 2007.

[12] 冯 璐， 栾雨时， 范永强， 等. 越橘叶斑病病原菌的鉴定[J]. 东北农业大学学报， 2007， 38（5）： 614-618.

[13] 范永强， 栾雨时， 冯 璐. 越橘叶斑病原菌的拮抗菌筛选及其发酵条件优化[J]. 果树学报， 2008， 25（3）： 426-430.

[14] 冯 璐， 栾雨时， 范永强. 银杏外种皮提取物对病原菌Cylindrocladium colhounii的抑制作用[J]. 植物研究， 2007， 27（4）： 509-512.

[15] 程东美， 陆小军， 刘 任， 等. 哈茨木霉与杀菌剂对绿巨人褐腐病菌的抑制作用[J]. 广东农业科学， 2006（5）： 89-91.

责任编辑：古小玲