海南龙血树查尔酮合酶基因（DcCHS）的克隆及表达分析

王佳媛等

摘 要 利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆，得到1条1 456 bp的cDNA序列，命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区，编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上，具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku，等电点pI为6.14，稳定性极差，具有15个磷酸化位点，无跨膜结构，无信号肽，亚细胞定位在细胞质的可能性较大，并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明，DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。

关键词 海南龙血树；查尔酮合酶；克隆；表达

中图分类号 Q78 文献标识码 A

Cloning and Expression Analysis of Chalcone Synthase Gene

（DcCHS）in Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep

WANG Jiayuan1，2， DAI Haofu2， LI Huiliang2， GUO Dong2， PENG Shiqing2 *， MEI Wenli2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract The full-length cDNA encoding chalcone synthase， designated as DcCHS， was isolated from Dracaena cambodiana by the RACE method. DcCHS contained a 1 173 bp open reading frame with 99 bp 5'UTR and 184 bp 3'UTR. The deduced DcCHS protein consisted of 390 amino acid residues with a calculated molecular weight of 42.7 ku and isoelectric point（pI）of 6.14. The deduced DcCHS， which shared more than 84% identities with the CHS protein from other plants， was predicted to possess the conserved CHS_like domain， active sites and signal sequences. DcCHS expressed at different levels with the highest transcription in the flowers， and the lowest transcription occurring in stems. The present study perhaps contributes towards an understanding of the characteristics in expression mechanism of DcCHS.

Key words Dracaena cambodiana； Chalcone synthase； Clone； Expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.016

海南龙血树（Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.），又称小花龙血树，龙舌兰科龙血树属植物。国内主要分布在海南的三亚、陵水、万宁等地，国外在越南、柬埔寨也有分布。海南龙血树是传统名贵中药血竭的一种基源植物[1]，血竭具有抗炎、止痛、止血、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性[1-3]。血竭的化学成分主要包括黄酮类化合物和皂苷类化合物[4]。其中，黄酮类化合物主要有黄酮、二氢黄酮、异黄酮、黄烷、异黄烷、高异黄烷、查尔酮、二氢查耳酮等，是血竭药理活性成分的主要来源[5]。目前，国内外关于血竭的研究主要集中在化学成分及药理活性方面[6]，对其血竭形成的分子机理还不清楚。

为了研究血竭形成的分子机制，蔡文伟等[7]利用抑制消减杂交技术从龙血树中分离得到51条可能与血竭生物合成相关的基因片段，但还未见这些基因的功能鉴定的进一步报道；张浩等[8]克隆了龙血树的钙依赖型蛋白激酶（CDPK）基因DCDPK2，可能与血竭合成的调控相关；Wang等[9]克隆了苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因DcPAL1，证实了DcPAL1参与血竭合成过程。

查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）是黄酮类合成的第一个关键酶[10]，催化香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成苯基苯乙烯酮，这一过程为黄酮类物质提供了基本的碳骨架。自1983年首次在欧芹中克隆CHS以来[11]，一些植物中的CHS相继被克隆[12-17]。在高等植物中CHS以基因家族的形式存在。从结构上看，多数CHS包含1个内含子和2个外显子，且内含子的位置大致相同[18]。研究结果表明，植物中的CHS不同成员在发育、组织特异性及抗胁迫调控中起到不同作用[19-20]。笔者在GenBank中发现1条698 bp的龙血树CHS序列（GenBank： JN377586），但该序列没有完整的阅读框架以及3′和5′序列。Blastx比对表明该片段编码氨基酸序列与其他植物的CHS相对应区域的同源性高达90%以上，表明该片段是龙血树CHS片段。本研究根据该序列设计引物，通过RT-PCR和RACE技术克隆其全长cDNA，并对其进行了生物信息学和组织表达特异性分析，以期为进一步探讨海南龙血树中黄酮类次生代谢调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 多年生龙血树种植在中国热带农业科学院热带生物技术研究所。龙血树根、茎、叶、花、果实采集后用于组织特异性表达分析。

1.1.2 质粒、试剂与菌株 克隆载体pMD19-T、Taq DNA聚合酶、T4-DNA连接酶、IPTG和X-gal购自TaKaRa公司；FastStart Universal SYBR Green Master购自Rox公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo公司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司；DNA回收试剂盒购自Qiagen公司；普通质粒小提试剂盒购自Real-Times公司；其他试剂均为国产分析纯；E. coli DH10B由本实验室保存；引物合成、DNA测序由北京诺赛生物技术有限责任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 海南龙血树总RNA的提取和cDNA第一链的合成 取海南龙血树不同的组织，在液氮中研磨，参照文献[21]进行总RNA的提取。cDNA第一链的合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

1.2.2 海南龙血树CHS保守序列的克隆 根据NCBI中已登录的海南龙血树CHS部分序列（GenBank： JN377586.1），设计特异引物F1（5′-TCGATGATCAA

GAAGCGATACATG-3′）和R1（5'-CAGTCCGAGATTC

CCAACGGCTT-3′）。以海南龙血树总RNA的反转cDNA作为模板，按照下列体系对CHS进行扩增：在0.2 mL离心管中加入10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、引物各1 μL、cDNA 1 μL，加ddH2O至总体积为20 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；然后94 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，进行40个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收。将回收的PCR产物与pMD19-T连接，转化到DH10B菌株，在氨苄抗性平板上进行蓝白斑筛选，再经PCR检测后送北京诺赛生物技术有限责任公司测序。

1.2.3 RACE技术扩增3′端和5′端 根据获得的CHS部分序列设计3′RACE和5′RACE引物（表1）。cDNA的合成以及3′RACE和5′RACE的扩增按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行操作。PCR产物经回收、克隆和鉴定后送北京诺赛生物技术有限责任公司测序。

1.2.4 海南龙血树全长CHS的克隆 根据获得的DcCHS序列的拼接结果，设计引物DcCHSF（5′- ATGGTGGCCATCGATGAGATCCGCAG-3′）和DcCHSR（5′-GTTAGTAGCCACACTGCGCAGCACG-3′）。扩增条件同1.2.2，PCR产物经回收、克隆和鉴定后送北京诺赛生物技术有限责任公司测序。

1.2.5 DcCHS生物信息学分析 通过NCBI上的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）对全长cDNA序列进行序列比对分析及开放性阅读框（ORF）的预测；利用DNAMAN软件进行同源物种分析；利用MEGA5.1进行系统进化树分析；通过NCBI上的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和Inter-ProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）进行功能结构域和功能位点预测[22]；利用ExPASy服务系统中的ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测分析蛋白质基本理化性质[23]；利用NetPhos2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行磷酸化位点分析[24]；利用TMHMM Seiwerv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白跨膜区分析[24]；利用SignalP4.1 Server预测信号肽[24]；利用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）在线软件对该基因进行亚细胞定位[25]；利用LOOPP（http：//clsb.ices.utexas.edu/loopp/web/）预测蛋白质的二级结构[26]；利用SWISS-MODEL（http：//www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html）分析蛋白质的三级结构[27]。

1.2.6 DcCHS的组织特异性表达分析 根据获得的DcCHS序列设计实时荧光定量引物DcCHSQF（5′-GAGTCGATCCGGGGACTTGG-3′）和DcCHSQR（5′- GACACATGTTATAGAACCCAATTTCAACAGA

T-3′）。以本课题组已克隆的海南龙血树actin为内参基因设计引物DcACTQF（5′-ACCGAGAGAGGGTA

CTCATT-3′）和DcACTQR（5′-CCAGCTCCTGCTCGTA

ATC-3′）。实时荧光定量PCR在Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪上进行，反应体系按照FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒说明书进行。PCR扩增条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，进行50个循环。基因表达量由荧光定量PCR自带软件MxPro QPCR Software分析。

2 结果与分析

2.1 DcCHS的克隆

总RNA经测定OD260/OD280为2.09，OD260/OD230为1.92，表明RNA纯度较高。经琼脂糖凝胶电泳检测，RNA条带清晰，完整性较好（图1）。

通过PCR、3′和5′RACE扩增分别获得了698 bp的中间片段、532 bp的3′端片段和367 bp的5′端片段（图2-A、B、C）。将获得的3个片段进行拼接获得1456 bp的序列，拼接序列命名为DcCHS。DcCHS包括1 173 bp的开放阅读框，99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区（图3）。为了验证拼接结果的正确性，设计引物对预测的阅读框架序列进行扩增，得到大小约1 200 bp的片段（图2-D），序列测定结果与拼接结果序列完全一致。

2.2 生物信息学分析

推导的DcCHS与中国水仙（AFM36767.1）、小苍兰杂交种（AEO45114.1）、陆地棉（AEO96985.1）、三角叶杨（XP_002303820.1）、咖啡黄葵（AGW22222.1）、黄蜀葵（ACE60221.1）、甜橙（XP_006489796.1）、圆叶葡萄（ACN30003.1）等植物的CHS蛋白氨基酸序列同源性高于84%以上。DcCHS含有CHS蛋白共有的高度保守的CHS_like（16-384）和PLN03171（1-389）结构域，具有Ferrer等[28]对苜蓿CHS三维晶体结构研究中发现的Cys164、His303和Asn336三个活性位点，以及Kim等[29]对甘薯块根发育的研究中提到的2个决定底物特异性的苯丙氨酸残基Phe215、Phe265和一个极其保守的信号序列G378FGPG。功能域预测其4-228位为N末端蛋白，238-387位为C末端蛋白，而156-172位为查尔酮合酶活性位点。

对9种植物的CHS蛋白序列进行同源比对（图4），发现CHS在植物中的保守性很强。进一步分析其进化亲缘关系，发现海南龙血树与中国水仙、苜蓿的亲缘关系最近，而与同是单子叶植物的粳稻、玉米和高粱的亲缘关系较远（图5）。

对DcCHS蛋白进行理化性质及功能结构预测，推测该蛋白相对分子量为42.7 ku，等电点pI 6.14。其氨基酸含量最高的为亮氨酸，高达9.7%，这与CHS通过亮氨酸拉链来参与同源二聚体形成有关[30]。其半衰期小于30 h，脂溶性系数为91.79，稳定性极差。具有15个磷酸化位点（7个Ser，6个Thr，2个Tyr）（图3）。无跨膜结构，无信号肽，这点与绝大部分的CHS相一致。亚细胞定位在细胞质的系数为18.5，细胞质与核上为13.5，线粒体内膜上为9.0。通过LOOPP预测其蛋白质的二级结构图及SWISS-MODEL预测三级结构（图6）。

2.3 DcCHS的组织特异性表达分析

定量PCR分析结果表明，海南龙血树花中DcCHS表达量远远高于根、茎、叶和果实，而茎中表达量最低（图7）。黄酮类化合物代谢途径中一个常见的通路为花青素合成通路，而大量研究结果表明，CHS与花色有着密切的联系[31]。根据DcCHS在花中的特异性表达，推测该基因可能参与花色素的形成。

3 讨论与结论

目前一些植物的CHS相继被克隆[11-17]，在GenBank中也有海南龙血树CHS片段序列提交，但到目前为止还未见海南龙血树完整的CHS序列和表达分析的报道。本研究从海南龙血树克隆到DcCHS全长基因，该基因编码的蛋白质具有CHS家族保守存在的功能位点及结构域。对DcCHS蛋白的分析，为进一步研究DcCHS在海南龙血树中黄酮类化合物合成途径中的功能提供了基础数据。此外，作为黄酮类化合物代谢途径的第一个关键限制酶，其表达情况可能会对血竭的形成及品质造成影响。利用荧光定量PCR技术研究DcCHS在海南龙血树中组织特异性表达情况，结果表明，在正在结果的海南龙血树上，其花中DcCHS表达量最高，推测该基因可能参与花色素形成。在高等植物中CHS以基因家族的形式存在，而且具有组织特异性[18-20]，进一步分离龙血树CHS基因家族的成员并进行相关表达分析，探讨其与血竭形成的关系，将有助于阐明血竭形成的分子机制。

通过改变植物次生代谢产物合成途径中的关键酶基因的表达来提高次生代谢物的产量已有报道，如在青蒿中过量表达法尼基焦磷酸合酶基因，青蒿素的含量与对照相比提高了4倍[32]；Daudonnet等将来源酵母的法尼基焦磷酸合酶基因在烟草中超表达，固醇和胡萝卜素的水平得到提高[33]。如果在海南龙血树中提高DcCHS的表达量，就有可能提高海南龙血树的黄酮类化合物的量，从而提高血竭的产量。目前海南龙血树的转基因体系还不成熟，通过转基因在海南龙血树中过量表达DcCHS还很困难。但通过对DcCHS的表达与调控机制的深入研究，将有可能通过激素或化学调控等方式调控DcCHS的表达来提高血竭的产量。

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责任编辑：沈德发