三明野生蕉Whirly转录因子的克隆及其在低温胁迫下的定量表达分析

杨洋等

摘 要 以三明野生蕉叶片为材料，通过克隆获得Whirly基因的ORF，并研究Whirly基因在不同温度处理下的转录水平。结果表明：采用PT-PCR结合RACE技术，克隆得到三明野生蕉Whirly基因，其在GenBank的登录号为KC127691。Whirly的开放阅读框为738 bp，编码245个氨基酸。生物信息学分析显示，Whirly蛋白属于亲水蛋白，不具有信号肽，二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成，保守结构域预测显示该基因属于植物Whirly转录因子基因家族。实时荧光定量PCR分析显示，Whirly转录因子在不同低温胁迫下表达水平有较大差异，随着温度的降低，相对表达量呈“M”型变化模式，在20 ℃和4 ℃时达到较高的转录水平，结合前人研究结果可知，三明野生蕉Whirly转录因子可能参与了包括抗寒等多个抗逆途径的调控。

关键词 三明野生蕉；Whirly；基因克隆；生物信息学；荧光定量PCR

中图分类号 Q943.2 文献标识码 A

Cloning and Expression Under Low Temperature Conditions

of Whirly Transcription Factor in a Wild Banana

Accession（Musa spp.）from Sanming City

YANG Yang，LAI Gongti，LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China

Abstract In the paper， the open reading frame（ORF）of Whirly gene was cloned from a Sanming wild banana accession（Musa spp.）. The expression level of Whirly was studied under different temperature conditions. Whirly of Sanming wild banana was cloned by RT-PCR and the accession number was KC127691 in GenBank. Whirly contains a 755-nucleotides-long open reading frame（ORF），encoding a polypeptide of 245 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein was hydrophilic and without signal peptide. Whirly belongs to plant whirly transcription factors. The secondary structure was made of the alpha helix，beta sheet and coil. Real-time quantitative PCR results indicated that the expression level of Whirly transcription factor is quite different under different low temperature stress. With the temperature decreasing，the relative quantitative expression patten presented as “M”-type. The expression of Whirly peaked at the treatment of 20 ℃，and maintained a high levels at 4 ℃. Combining with previous studies，we predicted that whirly transcription factors may play an important role in many kinds of resistance response including cold-resistance.

Key words Sanming wild banana；Whirly；Gene cloning；Bioinformatics；QPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.015

芭蕉科（Musaceac）芭蕉属（Musa）的香蕉（Musa spp.）是多年生大型草本单子叶植物，其产量仅次于柑桔类水果，在世界水果生产中占有十分重要的地位[1]。中国香蕉在华南地区种植广泛，其生长对温度要求较高， 寒害严重影响香蕉的生长，使其产量大大降低[2]。福建省野生香蕉种质资源几乎覆盖所有地市，对三明、福州[3-5]等地的野生蕉研究已有详细报道。其中三明野生蕉耐寒性比较强，能够耐-5 ℃以下的低温[6]，可从中分离抗性目的基因资源，从而用于香蕉的抗性基因工程育种[7]。

Whirly（WHY）属于转录因子，Desveaux等[8]从土豆中分离出来的核转录因子PBF-2（PR-10a binding factor2），是第一个Whirly家族成员。随后Krause等[9]、Marechal等[10]又在拟南芥、土豆中发现其他成员，但目前尚未有香蕉Whirly克隆的相关报道。有研究发现，Whirly能与DNA以单链形式结合并调控抗性基因的表达，Whirly蛋白可与ERE元件[8，11]、端粒重复序列结合[12]，Xiong等[13]亦发现Whirly蛋白可与拟南芥AtKP1的上游元件结合。Despres等[14]发现StWhy1能特异地与ERE元件结合并诱导PR-10a基因的表达，而PR（pathogenesis-related protein）基因是可以被病原入侵激活表达的基因[15-16]，Whirly的抗病响应亦可是水杨酸-依赖的抗病反应[11]，RNA干扰技术可使水稻OsWhirly基因沉默并导致超敏反应（Hypersensitiveresponse，HR）增强[17]。Whirly转录因子参与多个抗逆途径，在抗病、抗衰老等多种生物抗性反应中发挥着重要的作用。有研究发现Whirly蛋白不仅在防御进程中发挥作用，在叶绿体和细胞核中也能起到一定的作用[18]。所以，研究Whirly转录因子具有重要的意义。三明野生蕉抗性较强，从三明野生蕉中分离Whirly基因对香蕉的抗性育种意义重大。本研究是在香蕉基因组的基础上，进一步克隆获得三明野生香蕉（Musa spp.）Whirly基因，采用生物信息学和荧光定量PCR方法对其进行初步的功能分析，深入研究Whirly转录因子在香蕉对低温胁迫的应答机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

三明野生蕉试管苗由本研究所提供，常温下培养三明野生蕉试管苗，将从中所提取的RNA经相应的反转录后用于Whirly基因克隆；试管苗分别经28、20、13、4、0 ℃处理36 h后，提取总RNA进行cDNA合成，用于荧光定量PCR（qPCR）分析，其中28 ℃处理为对照。

1.2 方法

1.2.1 三明野生蕉试管苗总RNA提取和cDNA合成 三明野生蕉叶片总RNA的提取按照北京天恩泽基因有限公司的柱式植物RNA out 2.0（Column Plant RNAout 2.0）试剂盒说明书进行。采用琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对所提取的总RNA进行质量和浓度检测。以提取的RNA为模板，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fementas）试剂盒，按照操作说明进行cDNA合成。

1.2.2 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆 参照小果野生蕉基因组（http：//banana-genome.cirad.fr/）已知Whirly序列，以三明野生香蕉叶片第一链cDNA为模板，利用DNAMAN 6.0软件设计的上下游引物分别为Whirly-F1（CCTGCAACGATGAGAAG

AACCT）和Whirly-R1（GCTCTGATTTACCTTCCCCA

CT），用于克隆三明野生蕉Whirly基因的开放阅读框（ORF）。PCR反应结束后，将获得的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的片段进行回收，连接于pMD 18-T载体上，最后委托铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.2.3 三明野生蕉Whirly基因生物信息学分析 采用NCBI在线BLAST比对基因cDNA序列及其推导的蛋白序列同源性。应用在线蛋白分析软件ExPASy ProtParam、ProtScale、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NCBI-ProteinTools的CDD及在线PSIPRED对所获基因推导的氨基酸序列进行分析，并利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.2.4 低温胁迫下三明野生蕉Whirly定量表达分析 三明野生蕉在低温胁迫下的定量表达分析按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）试剂盒的步骤，先进行反转录合成定量所需的cDNA。分别以28、20、13、4、0 ℃处理过的三明野生蕉试管苗cDNA为模板，采用荧光定量PCR技术对其进行定量表达分析。用于Whirly定量表达分析的上下游引物分别为Whirly-F2（5′-GCTTCCTCTCATGCAGCTCT-3′）和Whirly-R2（5′-TGGTGACACTGACAAGGCAG-3′）。PCR反应体系按照操作说明进行。每个反应设置3个重复。采用相对定量法[19]，以18S rRNA为内参基因，扩增引物为18S rRNA-F（CCTGAGAAACGGCTACCACAT）

和18S rRNA-R（CACCAGACTTGCCCTCCA），对目的基因的转录水平进行分析。

2 结果与分析

2.1 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆

以三明野生香蕉cDNA为模板，经PCR扩增获得700 bp左右的亮带，与设计的目的片段大小一致。经胶回收、纯化，以pMD l8-T为载体对回收片段进行TA克隆。取阳性克隆测序，测序获得755 bp片段，包含上下游引物序列。经序列比对分析可知，该片段与香蕉基因组Whirly及已登录GenBank的其他植物Whirly基因同源性较高，可认为是野生香蕉Whirly基因。克隆获得三明野生蕉Whirly基因ORF为738 bp，编码245个氨基酸（图1），其在GenBank中的登录号为KC127691。

2.2 三明野生蕉Whirly蛋白质基本理化性质及保守结构域分析

在线软件分析结果如下，Whirly蛋白分子量为27 012.7 u，理论等电点为9.68，属于碱性蛋白，预测结果还显示该蛋白是一个不稳定蛋白，不稳定系数为58.85，脂肪系数为74.37，总平均疏水指数（GRAVY）为-0.347，表明它是一个亲水蛋白，经ProtScale预测的结果与上述结果一致。利用NCBI-Protein Tools的CDD在线软件分析三明野生蕉Whirly的保守结构域（图2），由预测结果可知Whirly基因属于植物Whirly转录因子。

2.3 三明野生蕉Whirly蛋白质信号肽和亚细胞定位预测分析

用SignaIP4.1 Server对三明野生蕉Whirly进行信号肽的预测和分析，结果表明，其C、Y、S 值均小于0.5，由此预测三明野生蕉不具有信号肽，不属于分泌蛋白。亚细胞定位预测结果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于线粒体基质的可能性最大，还有部分位于线粒体内膜、线粒体膜间隙及线粒体外膜。这与SignalP 4.0程序对其进行信号肽的预测结果一致。因此可以推测该蛋白是在细胞膜或细胞内行使其功能。

2.4 三明野生蕉Whirly蛋白二级结构和三维结构预测分析

对三明野生蕉Whirly蛋白二级结构的预测表明，Whirly蛋白的结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。无规则卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。用SWISS-MODEL在线工具对野生蕉试管苗Whirly氨基酸序列进行蛋白质三维结构预测，图3显示了三明野生蕉Whirly蛋白是由α螺旋、β折叠片、β转角等成分组成的三维结构。

2.5 三明野生蕉Whirly与其他植物Whirly蛋白的同源性和分子系统进化分析

将Whirly氨基酸序列进行NCBI-BLAST比对分析，结果发现该序列与短柄草Why2、玉米Why2、水稻Why2、高粱Why2、拟南芥Why2、苹果Why、马铃薯Why2、葡萄Why2、可可Why2等的相似性较高，分别为56%、54%、53%、52%、46%、45%、45%、43%、42%。采用MEGA5.0软件构建三明野生蕉Whirly的系统进化树（图4），发现三明野生蕉Whirly与单子叶禾本科植物的高粱、玉米、水稻和短柄草Whirly2的亲缘关系比较近，而与双子叶十字花科的拟南芥等植物的Whirly1亲缘关系较远。

2.6 Whirly基因在低温胁迫下的定量表达分析

待三明野生蕉Whirly和内参基因qPCR反应结束后进行扩增曲线和溶解曲线分析。结果表明，Whirly引物和18SrRNA引物特异性好，标准曲线符合试验要求。Whirly基因在不同温度下的转录水平见图5，三明野生香蕉相对表达量呈“M”型变化模式，以28 ℃处理为对照，当温度下降到20 ℃处理36 h时，Whirly基因表达量上调至对照组的8.16倍，达到峰值；当处理温度为13 ℃时，Whirly基因表达量为对照的3.13倍；当处理温度为4 ℃时，Whirly基因的表达量再次上升，维持在较高的水平，为对照的5.62倍；当温度为0 ℃时，Whirly基因的表达量下降至对照的4.52倍。综上可知，当温度为20 ℃和4 ℃时，Whirly具有2次转录高峰，因此Whirly转录因子在这2次高峰中可能参与了不同的转录调控途径。

3 讨论与结论

3.1 三明野生蕉Whirly蛋白结构的特异性

Whirly蛋白是植物特有的高度保守的家族蛋白。本研究对三明野生蕉Whirly蛋白进行生物信息学分析发现，Whirly蛋白不具有信号肽，不属于分泌蛋白，而有研究发现拟南芥的3个Whirly蛋白都有叶绿体或线粒体信号肽[20]，因此，三明野生蕉Whirly蛋白具有独特结构。亚细胞定位预测结果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于线粒体基质的可能性最大，还有部分位于线粒体内膜、线粒体膜间隙及线粒体外膜，这与孔凡英等[21]预测的结果基本一致，在质体内含量较丰富的Whirly蛋白属于碱性蛋白，其中Ser、Leu、Pro所占比重较大。二级结构中无规则卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。三维结构预测显示，Whirly蛋白表面有一个中心空穴并形成带电的内腔，与已有研究相符。进化树分析发现，Whirly蛋白与单子叶禾本科植物的亲缘关系比较近，因此三明野生蕉Whirly蛋白具有与其他单子叶禾本科植物相似的生物学功能。

3.2 三明野生蕉Whirly可能参与多个抗逆途径

研究表明，Whirly参与多个抗逆途径，在多种生物抗性反应中发挥重要的作用Despres等[14]发现StWhy1具有诱导PR-10a基因表达的作用，而PR基因是可以被病原入侵激活表达的基因[15-16]。Desveaux等[11]发现AtWhy1在与水杨酸反应时会被激活并参与水杨酸-依赖的抗病反应，AtWhy1单链结合蛋白表达受水杨酸分子影响[22-23]。目前发现的抗病相关的Whirly基因家族成员有ssi1、ssi2、cpr5、cpr6和hrl1[24-27]。由此可见，Whirly参与了植物抗病响应途径。Krause[9]等发现在大麦嫩叶中，Whirly1蛋白定位在质体，但在衰老叶片中则定位在核内，而Wingler[28] 研究发现，AtWhy2基因的敲除突变体能够延迟衰老，表明Whirly转录因子在衰老调控中也起重要作用。本试验通过生物信息学预测和定量表达分析，发现Whirly在不同温度处理下出现2次表达高峰，分别是20 ℃和4 ℃，可见Whirly基因参与了三明野生蕉的低温响应，在抗寒相关基因的转录过程中发挥着重要的作用。结合前人的研究结果推测，Whirly可能参与了包括抗寒在内的多种抗逆途径的转录调控过程，因此研究Whirly转录因子有着广泛而深远的意义。

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责任编辑：林海妹