金钗石斛多糖对高糖诱导的大鼠INS—1细胞胰岛素分泌的影响

赵亨 昌智平 张艳磊 唐彦萍

【摘 要】目的：观察金钗石斛多糖对高糖诱导的大鼠INS-1细胞胰岛素分泌能力的影响。方法：将大鼠INS-1细胞分成6组，正常对照组（NC），高糖作用组（HG），罗格列酮组（ROZ），金钗石斛多糖低（LD）、中（MD）、高（HD）浓度干预组。各组药物作用48h后再用高糖作用1h，提取上清分别观察胰岛素分泌情况。用酶促化学放大发光法测定各组上清液的胰岛素含量。结果：与高糖作用组相比，金钗石斛多糖高、中浓度组细胞的胰岛素分泌量明显增多（P<0.05）。结论：金钗石斛多糖能增加高糖诱导的INS-1细胞的胰岛素分泌量。

【关键词】金钗石斛多糖；大鼠；INS-1；胰岛素

【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-2456-02

Effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells

cultured in high glucose

Zhao heng， Chang zhi-ping， Zhang yanlei，Tang Yan-ping

（Departement of zunyi Medcal College， Gueizhou， Zunyi 563099，China ）

【Abstract】Objective： To observe the effect of Dendrobium nobile polysaccharides on insulin secretion by rat INS-1 cells cultured in high glucose. Methods： We divided into six groups include normal control group （NC）， high glucose control group （HG）， rosiglitazone control group （ROZ）， Dendrobium nobile polysaccharides low dose group （LD）， middle dose group （MD）， high dose group （HD）， and each group was detected by 48hs foster.Then stimulated the cells to secreting insulin by high glucose for 1h， and extracted the supernatant fractions. We measured the insulin levels by chemiluminescence enzyme immunoassay. Results： Dendrobium nobile polysaccharides middle dose and high dose group had higher insulin levels than high glucose control group（P<0.05）. Conclusion： Dendrobium nobile polysaccharides can increase the levels of insulin secreted by rat INS-1 pancreatic cells which cultured in high glucose.

【Keywords】Dendrobium nobile polysaccharides； rat；INS-1； insulin

Ⅰ型糖尿病典型的临床特征是由于胰岛素绝对或相对不足所致的高血糖。胰岛素是机体内唯一能降低血糖的激素，也是唯一一种同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。它是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。而高血糖会损害胰岛β细胞，研究 [1，2]表明，高血糖对胰岛β细胞的损害主要表现在：1、加重胰岛素分泌的缺陷和胰岛素抵抗（IR）。2、诱导胰岛β细胞发生凋亡。当β细胞凋亡或者分泌功能产生缺陷时，其最直接的表现就是胰岛素分泌量的减少。金钗石斛是我国的传统名贵中药，具有延年益寿，抗肿瘤，抗衰老和增强抵抗力等作用。李菲等[3]研究发现，金钗石斛多糖和生物碱对肾上腺素性高血糖小鼠有降血糖作用。同时，本课题组刘圆圆等[4]研究表明，金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病大鼠肾脏起到了保护作用。由于大量高纯度的β细胞难以获得，本研究采用大鼠INS-1细胞予以代替。我们主要采用不同浓度的金钗石斛多糖对高糖诱导的INS-1细胞进行药物干预，观察其胰岛素分泌量的变化，初步判断金钗石斛多糖的作用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

金釵石斛（遵义赤水金钗石斛基地提供）；大鼠胰岛素瘤细胞INS-1（上海博慧斯公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；DEAE Sepharose Fast Flow（美国GE公司）；马来酸罗格列酮（天津葛兰素史克公司）；IMMULITE ?1000（美国SIEMENS公司）；胰岛素测定试剂盒（美国SIEMENS公司）。

1.2 方法

1.2.1 金钗石斛多糖提取

采用本课题组张艳磊等[5]的提取方法，先对金钗石斛茎进行脱脂、水提醇沉，然后用sevag法脱蛋白与透析除去小分子物质，最后经过阴离子交换柱进行进一步纯化。

1.2.2 细胞培养

将INS-1细胞于RPMI-1640培养液（含11.1 mmol/l 葡萄糖，10%FBS，50μmol/l 2-巯基乙醇，1 mmol/l丙酮酸，10 mmol/l HEPES）中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养。

1.2.3 实验分组

实验分成6组：NC组（含11.1 mmol/l葡萄糖的普通培养液），HG组（含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培养液），ROZ组（高糖培养液+80μmol/l的罗格列酮），LD组（高糖培养液+0.04μg/ml的金钗石斛多糖），MD组（高糖培养液+0.4μg/ml的金钗石斛多糖），HD组（高糖培养液+4μg/ml的金钗石斛多糖）。INS-1细胞在普通培养液涨到80%～90%时，加入含0.5%FBS的普通培养液同步化24h。到时间后，按各分组加入不同的培养液，培养48h。

1.2.4 胰岛素分泌量测定

INS-1在含不同成分的培养液中培养48h后，除去培养瓶中上清。在各培养瓶中重新加入含22.2 mmol/l葡萄糖的高糖培养液，并孵育1h。收集上清液，用酶促化学放大发光法测定胰岛素含量，每组重复3次。

2 统计学分析

数据采用SPSS 19.0软件进行处理，实验结果以均数±标准差（ ± s）表示。采用Duncan-t检验，以P<0.05代表差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 多糖提取结果

利用DEAE Sepharose Fast Flow分离纯化后，得到中性多糖成分，其多糖含量为98.1%，研究认为结果可靠，可用于后续实验[5]。

3.2 胰岛素分泌量测定结果

4 讨论

糖尿病是高血糖症、高脂血症、胰岛淀粉样物质的沉积等因素的联合作用，使机体的内环境稳定性逐渐破坏，引起各种慢性并发症[1]。胰岛β细胞的功能障碍和凋亡与Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的发病都密切相关[6]，其中一个直接表现就是胰岛素的分泌大量减少。本实验结果也显示，与正常对照组相比，高糖作用组能显著抑制胰岛素的分泌（P<0.05）。中药治疗糖尿病的机制包括：抑制α-糖苷酶、胰岛素样作用、修复β细胞增加胰岛素的分泌、减少胰高血糖素的分泌、提高机体对胰岛素的敏感性.本研究结果显示，与高糖组相比，金钗石斛多糖低、中、高浓度组能在不同程度上增加胰岛素的分泌量（P<0.05）。这个结果提示，金钗石斛多糖可能在一定程度上能减少高糖作用下β细胞的凋亡和（或）恢复其胰岛素分泌功能。或许金钗石斛多糖能以此为基础在一定程度上减轻糖尿病患者的各方面症状。虽然这3组不同浓度的金钗石斛多糖在与ROZ组相比时，效果没罗格列酮明显（P<0.05）。但是，罗格列酮有一定的副作用，陈忻等[7]发现罗格列酮会增加65岁以上糖尿病患者患心血管病的风险。而金钗石斛多糖作为一种中药提取物，目前尚未发现其对人体的副作用。总之，金钗石斛多糖能够增加高糖诱导下INS-1细胞的胰岛素分泌，并且无副作用，在糖尿病治疗的研究中应对其多加开发利用。

近年来，对胰岛素分泌的研究主要集中在它的几个转录因子上，其中比较重要的有MafA、Pdx1和Beta2[8].这3个基因共同调控着胰岛素基因的转录。近来又有学者提出，其中的MafA是β细胞功能完善的关键基因，但具体过程尚未了解[9]。那么，金钗石斛多糖能否在基因水平上影响β细胞的胰岛素分泌呢？本人对这方面的研究探索也已开展。继续深入的研究，有助于开发金钗石斛的药用价值，并且可能为糖尿病的治疗提供新靶点。

参考文献：

[1] Mellado-Gil J M， Aguilar-Diosdado M. High glucose potentiates cytokine-and streptozotocin-induced apoptosis of rat islet cells： effect on apoptosis-related genes[J]. Journal of endocrinology， 2004， 183（1）： 155-162.

[2] Zeender E， Maedler K， Bosco D， et al. Pioglitazone and sodium salicylate protect human β-cells against apoptosis and impaired function induced by glucose and interleukin-1β[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2004， 89（10）： 5059-5066.

[3] 李菲， 黃琦， 李向阳， 等. 金钗石斛提取物对肾上腺素所致血糖升高的影响[J]. 遵义医学院学报， 2008， 31（1）： 11-12.

[4] 刘园园， 何晓然， 张艳磊， 等. 金钗石斛水煎剂对糖尿病肾病大鼠肾脏 iNOS 表达的影响[J]. 遵义医学院学报， 2013， 36（4）： 291-293.

[5] 张艳磊， 何晓然， 刘园园， 等. 金钗石斛多糖对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞氧化应激的影响[J]. 时珍国医国药， 2013 （1）： 7-9.

[6] Kaufman R J. Beta-cell failure， stress， and type 2 diabetes[J]. New England Journal of Medicine， 2011， 365（20）： 1931-1933.

[7] 陈忻， 杨丽， 翟所迪. 罗格列酮和吡格列酮对 65 岁以上糖尿病患者心血管事件风险的 meta 分析[J]. 药物不良反应杂志， 2011， 13（2）： 73-77.

[8] Han S， Yasuda K， Kataoka K. ATF2 interacts with β-cell-enriched transcription factors， MafA， Pdx1， and Beta2， and activates insulin gene transcription[J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（12）： 10449-10456.

[9] Aguayo-Mazzucato C， Zavacki A M， Marinelarena A， et al. Thyroid Hormone Promotes Postnatal Rat Pancreatic β-Cell Development and Glucose-Responsive Insulin Secretion Through MAFA[J]. Diabetes， 2013， 62（5）： 1569-1580.

基金项目：

贵州省卫生厅科学技术基金项目（No：gzwkj2013-1-064）。

通信作者：

唐彦萍（1953-），女，教授，研究方向：药物分子生物学，E-mail：tiantian8609445 @163.com