胃癌中医辨证分型与胃癌细胞对化疗药物体外敏感性的相关性研究

周小丽 杨宇 王涛

【摘 要】目的：探討胃癌患者中医辨证分型与癌细胞对紫杉醇（PTX）、丝裂霉素（MMC）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂（DDP）、多柔比星（ADM）5种化疗药物体外敏感性之间的关系。方法：对河南省肿瘤医院普外科2011年10月至2012年12月收治的60例胃癌患者进行术前中医辨证分型，分为肝胃不和、气血亏虚、脾胃虚寒、痰食瘀阻四型，将手术后所获取癌组织送实验室提取胃癌细胞，超低温冻存。分别取4种证型患者胃癌细胞进行体外培养，制备单细胞悬液，分为实验组和空白对照组，利用MTT法测定不同证型患者胃癌细胞对紫杉醇、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂、多柔比星的体外敏感性，计算上述5种化疗药对不同证型胃癌细胞的抑制率。结果：在同一证型组不同患者胃癌细胞对5种化疗药物敏感性无显著性差异（P>0.05）。不同证型组对5种化疗药的敏感性两两相比，气血亏虚组与肝胃不和组比较有显著性差异（P>0.05），气血亏虚与痰食瘀阻组比较相有显著性差异（P<0.05），其他证型组间均无显著差异（P>0.05）。结论：胃癌患者中医辨证分型与其癌细胞在体对外对5种化疗药物的敏感性相关。痰食瘀阻组、肝胃不和组、脾胃虚寒组胃癌细胞对5种化疗药物较敏感，气血亏虚组不敏感甚至耐药。其中，肝胃不和型对化疗药最敏感，其次为脾胃虚寒型、痰食瘀阻型，气血亏虚型最差，中医辨证分型有助于判断胃癌细胞在体外对化疗药物的敏感程度。

【关键词】胃癌；中医辨证分型；癌细胞；化疗药物敏感性

【中图分类号】R476 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）04-2440-02

Study on the correlation between the sensitivity that the gastric cancer cells reacting to chemotherapeutics and the TCM Syndrome Types

Xiaoli Zhou 1， Yu Yang2， Tao Wang3

（1.Pharmacy Department， The First Affiliated Hospital College Of TCM of Henan， Zhengzhou 450000）

（2.Shangqiu hospital of traditional Chinese medicine ， Shangqiu 476000）

（3.Department of Hemato-tumor， The First Affiliated Hospital College Of TCM of Henan， Zhengzhou 450000）

【ABSTRACT】Object To investigate the correlation between the TCM Syndrome Types of gastric cancer and the cancerous cells sensitivity reacting to 5 different types of chemotherapeutics（paclitaxel， mitomycin， fluorouracil，cis-platinum， Adriamycin） in vitro experiment. Methods 60 gastric cancers treated at Henan Cancer Hospital from October 2011 to December 2012 were divided into 4 groups （group of liver-stomach disharmony， group of deficiency of qi and blood， group of insufficiency-cold in spleen and stomach， group of phlegm-dampness stagnation）， gather the cancer cells after surgeris and stored at a ultra-low temperature in the laboratory. Then the cancer cells cultured in vitro were divided into experimental group and control group， test the sensitivity that the cancer cells from the 4 groups reacting to the 5 different chemotherapeutics and count the depression rate that the 5 different chemotherapeutics impose on the cells . Results There are no obvious differences between the cancer cells of different patients in the same group when the sensitivity of chemotherapeutics were tested. The sensitivities that different groups reacting to the 5 chemotherapeutics were compared in pairs， then we could see that there were obvious differences between the group of deficiency of qi and blood and the group of liver-stomach disharmony（P<0.05）， or the group of deficiency of qi and blood and group of phlegm-dampness stagnation（P<0.05），since there were no obvious differences between the other groups. Conclusion The sensitivity that the cancer cells reacting to the 5 chemotherapeutics in vitro has certain relations with the Chinese medical syndromes. The gastric cancer cells from the group of phlegm-dampness stagnation， the group of liver-stomach disharmony， group of insufficiency-cold in spleen and stomach are more sensitive to the 5 chemotherapeutics， while the cells of the group of deficiency of qi and blood are not sensitive or even expresses certain drug resistance. Of all groups， cells of liver-stomach disharmony group have the highest sensitivity， from higher to lower， are insufficiency-cold in spleen and stomach group， phlegm-dampness stagnation group， deficiency of qi and blood group. Thus we can conclude that the Chinese medical syndromes contribute to justify the sensitivity of the gastric cancer cells reacting to the different chemotherapeutics.

【KEYWORDS】gastric carcinoma， Chinese medical syndromes， cancer cells， chemotherapeutics， sensitivity

前言

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，发病率为10-15/10万，对人类生命和健康构成严重威胁。我国每年胃癌患者死亡超过16万人，约占肿瘤患者全部死亡人数的1/5，仅次于肝癌[1-2]。河南省是中国胃癌病高发地区之一，胃癌的标化死亡率为30/10万～90/10万。深入研究胃癌，改善患者的生存质量和延长生存期，是每一个肿瘤医务人员的当紧要务。

目前，中晚期胃癌患者主要治疗方式仍然是化疗，随着医疗科技的进步，患者中位生存时间已有显著提高，但是化疗的持续有效性仍是大家关注的一大问题。随着新细胞毒性药物的出现，胃癌治疗有了长足进展。但统计显示，仍有37～65.5%的胃癌患者不能从中受益。个体差异使得肿瘤细胞对化疗药物产生交叉耐药是其原因之一[3]。常用的顺铂（DDP）联合5-氟尿嘧啶（5-FU）标准化疗方案治疗胃癌，有效率也仅为20～50%[4]。由于肿瘤患者的“异质性”，同一化疗方案对不同的患者也有很大疗效差异。因此采取个体化化疗能够在提升化疗有效率的同时减少不良反应，有长远的发展前景。资料显示，肺癌个体化化疗上已获得巨大进步 [5]，但胃癌个体化化疗的研究还处于起步阶段。

在众多医疗同行努力下，已发掘出诸多治疗胃癌的行之有效的中医药方法。在辨病专方治疗以及中西医结合治疗胃癌、缓解临床症状、延长生存期方面，都显示出了一定优势。中西医结合对胃癌实行个体化治疗是未来的一个发展方向。辨证论治是中医学的精华，《素问》云：“谨守病机，勿失其宜”。辨证实际就是抓主要症候认识病机。不同中医证型，都存在着不同的生化、生理、病理差异。这些差异是影响不同个体疗效的因素所在，也是研究中医证型的关键。

MTT具有简捷、快速等优点，临床相关性较好，近来被广泛应用于体外药敏试验[6-7]。用MTT法检测胃癌细胞在体外对化疗药物的敏感性，找寻胃癌细胞对化疗药物的敏感性与中医辨证分型之间相互关系，能为患者的化疗药物选择提供依据，有利于临床医师根据辨证论治设计治疗方案，制定出最佳的治疗途径。

1资料与方法

1.1 诊断标准 按照1999出版的《新编常见恶性肿瘤诊治规范﹒胃癌分册》[8] 诊断标准：①多有上腹持续疼痛，溃疡灶、侵犯骨膜或神经引起的疼痛；②早期无体征，晚期消瘦、脱水；③胃胃餐增强型CT检查：清晰的看到胃癌累及胃壁，周围组织的关系，有较大的腹盆腔转移；④确诊依据：胃细胞学检查；⑤胃镜检查：早期胃癌的发现，良恶性溃疡的鉴别，胃癌和病灶类型范围。发现胃溃疡或慢性萎缩性胃炎。病理活检报告其细胞异型增生程度，重度异型增生者按早期癌对待。

1.2 中医辨病辨证分型标准 中医辨病辨证分型参考2003年人民卫生出版社出版，陈锐深教授主编的《现代中医肿瘤学》[9]的础上，结合临床实际，将胃癌分为以下四个证型：1.肝胃不和证：胃脘胀痛，窜及两胁，嗳气陈腐或呕吐反胃。饮食减少，进行性消瘦，口苦心烦，大便干结。舌质暗红.苔薄黄，脉弦细。2.痰食瘀阻证：胃脘胀痛，固定不移，或有肿块，按之坚硬，厌恶肉食，频频嗳腐，呕吐痰食，精神疲惫，形体赢瘦。大便干涩，或有呕血便血。舌质暗红或见瘀点，苔白，脉弦。3.脾胃虚寒证：胃脘隐痛，喜按就温，或朝食暮吐，暮食朝吐，时呕清水，面色皖白，神疲肢冷，纳呆短气，便溏腹泻，舌质淡胖，边有齿印，苔白润，脉沉细或沉缓。4.气血亏虚证：面色苍自，颜面虚肿.畏寒身冷，神疲乏力，心悸气短，头晕目眩，心下痞块。纳少自汗，骨瘦如柴；舌质淡暗，苔少、脉细弱无力。

1.3 纳入标准及排除标准 纳入标准：①原发性胃癌；②病理报告确诊是胃癌的患者；③40～65周岁；④没有心、肝、肾、脑、骨髓等功能障碍，无药物及食物过敏者。⑤既往未经手术、化疗、放疗、中医药治疗等胃癌相关治療。排除标准：①确诊为精神病患者； ②存在第二肿瘤患者。

1.4 研究对象 选取2011年10月份—2012年12月份期间于河南省肿瘤医院收治的经胃镜取组织病理检查确诊的胃癌患者，按上述标准筛选，在手术前经过四诊合参、辨证分型，其中肝胃不和型15例、.痰食瘀阻型15例、脾胃虚寒型15例、气血亏虚型15例（以下简称A组、B组、C组、D组），术后获取癌组织。60例患者年龄在40～65岁之间，平均年龄50岁左右，其中男性患者31例，女性患者29例。

1.5 化疗药物及化疗药物的配置 紫杉醇（PTX）：山东鲁抗辰欣药业有限公司；顺铂（cisplatin，cDDP） 中国山东齐鲁制药厂；5-氟尿嘧啶（5-FU）；南通精华制药有限公司；阿霉素（adriamycin，ADM） 中国山东新华制药厂；5-氟尿嘧啶（5-fluorouraeil，5-FU） 中国上海华联制药有限公司；丝裂霉素（fitomucin，MMC） 中国黄石美升药业有险公司。实验药液配制：按临床常规化疗剂量配置实验药液浓度 [10]。取0.05葡萄糖水或生理盐水稀释成工作液，置于-20℃冰箱备用。药物浓度公式计算：?g∕ml=60×D∕（5000÷50%×1000）=24D。临床用药剂量：mg∕（kg·d）。设定平均成人体重为60kg；血细胞比容50%[11]。所用化疗药物的实验浓度如下：ADM 25.0 mg∕（kg·d）；PTX 0.35 mg∕（kg·d）；DDP 3.8 mg∕（kg·d）；5-FU 21.0 mg∕（kg·d）；MMC 30.0 mg∕（kg·d）。

1.6 肿瘤组织单细胞悬液的制备 取胃癌患者术后癌组织，按文献方法[12]制备细胞悬液后，把PH调整为7.2～7.4。把细胞浓度调整为1×106ml，放于5%浓度的CO2培养箱中，37℃常温培养过夜。

1.7 MTT比色分析法 将制备成好的胃癌细胞悬液分别依次种入96孔培养板中，每孔100μL，后用RPMI-1640加至总量200μL。空白对照组设3行。同一培养条件下培养24小时。然后在实验组每孔20μL化疗药物，混匀继续培养2天。用快速翻板法，弃上清液后每孔加入MTT ：20μL（浓度5g/L），继续培养8小时后进行离心，弃上清。镜下目测MTT蓝色结晶数：每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100μL中止反应。放振荡器振荡后置于镜下观察，见结晶完全溶解。放入酶标仪以490nm波长检测光密度值，以光密度值直接推测出各种化疗药对肿瘤细胞的抑制率。

1.8 计算抑制率 参考实体瘤体外敏感标准：（1）抑制率≥70%为体外高度敏感；（2）抑制率<30%定为耐药；（3）抑制率>30%定为敏感；（4）30%≤抑制率<50%为低度敏感。（5）50%≤抑制率<70%为中度敏感；抑制率=（对照孔OD值-加药孔OD值）∕对照孔OD值×100%。淋巴细胞的相对抑制率>20%、肿瘤细胞的相当抑制率>30%判断为药敏阳性。

1.9 统计学方法 抑制率以 ±s表示；同一证型组内比较采用两因素方差分析比较；不同证型组间的两两比较采用重复测量资料方差分析F检验、q检验比较。以P<0.05为差异有统计学意义。借助SPSS17.0统计软件处理和分析。

2 结果

2.1 5种化疗药分别对60例胃癌患者胃癌细胞的平均抑制率（表1）

结果显示，在对胃癌细胞体外抑制试验中，5种化疗药分别对60例胃癌患者的抑制率的平均值从高到低依次为：PTX>DDP >5-FU>MMC>ADM。5种常用化疗药物对胃癌细胞中度敏感，用SPSS17.0统计软件包进行数据处理，用单因素方差分析法无显著性差异（P>0.05）。

2.2 化疗药物对不同证型患者胃癌细胞的抑制率（表2）

肝胃不和、痰食瘀阻和脾胃虚寒与气血亏虚组比较，P<0.05。

2.3 各组证型间两两化疗药物的抑制率比较

A组：5种化疗药物对胃癌肝胃不和型患者的胃癌细胞的抑制率由高到低依次是：PTX、DDP 、5-FU、MMC、ADM，在本试验中，胃癌对以上5种常用化疗药物较敏感；各药物抑制率比较结果显示无显著性差异，P>0.05。

B组：5种化疗药物对痰食瘀阻胃癌患者的胃癌细胞的抑制率由高到低依次是：PTX、DDP、5-FU、MMC、ADM，在本试验中，胃癌对以上5种常用化疗药物较敏感；各药物抑制率比较结果显示无显著性差异，P>0.05。

C组：5种化疗药物对脾胃虚寒胃癌患者的胃癌细胞的抑制率由高到低依次是： PTX、DDP、MMC、5-FU、ADM，在本试验中，胃癌对以上5种常用化疗药物较敏感；各药物抑制率比较结果显示无显著性差异，P>0.05。

D组：5种化疗药物对气血亏虚型胃癌患者的胃癌细胞的抑制率由高到低依次是：MMC、PTX、5-FU、DDP、ADM，在本试验中，胃癌对以上5种化疗药物不敏感甚至呈现出耐药现象；各药物抑制率比较结果显示无显著性差异，P>0.05。

2.4 四种证型的抑制率两两比较

组间两组证型对化疗药物的敏感性相比较：肝胃不和组与气阴两虚组相比，有显著性差异（P<0.05）；痰食瘀阻组与气血亏虚组相比，有显著性差异（P<0.05）；脾胃虚寒组与气血亏虚组相比，无显著性差异（P>0.05）；肝胃不和组与痰食瘀阻组相比，无显著性差异（P>0.05）；肝胃不和组与脾胃虚寒组相比，无显著性差异（P>0.05）；痰食瘀阻组与脾胃虚寒组相比，无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

中医学本无胃癌病名，但自古对其不乏认识，根据临床表现，将其列为“伏梁”、“胃脘痛”、“症瘕积聚”、“反胃”、“噎膈”等范畴。《诸病源候论》认为癓瘕、积聚是由于饮食、寒温不调使得脏腑之气固结于内，久之积聚成有形之实邪，实邪与血气相搏，与脏器相挣，逐日盗取人之精气发为危症。张子和《儒门事亲》：“因气动而内成者，谓积聚、癓瘕...”，推论气机失调导致积聚、癓瘕生；正气不足由于阴虚火旺，耗伤津液。朱丹溪《丹溪手镜》说：“盖因脉虚火起，气虚火炽，血液既耗，肠胃津涸，传化失宜...皆令食而复出也。大概因津血俱耗，胃腕亦槁，在上近咽之下，水饮可行，食物难入...即翻胃也”。胃癌之为病，不外乎外感和内伤。有学者认为脾胃学说在胃癌的机理和治疗中至关重要，脾胃虚弱之人易有胃癌的发生。扶正培元，培补脾胃可使胃癌患者人体阴阳趋于平衡、延长生存率[13-14]。在藏象学说中将胃的病变与肝脾两脏结合起来研究，说明脾胃的后天作用，脾胃主持人体气血生化，调节脏腑之间平衡 [15]。林赛玉，黄可成[16]通过对70例胃癌患者的通气功能检测，阐述了“母病及子”的关系和肺、脾、胃的关系，从整体着眼对胃癌加以认识。刘嘉濑、李岩[17]认为正气虚弱、邪气强实是胃癌的发病关键，影响着肿瘤发生、发展与变化，应注重治病求本、健脾补肾；重视后天，调补脾胃。钱伯文[18]通过大量的临床资料观察到，胃癌患者在癌变期多有长期的郁闷忧憋或蒙受打擊的经历，认为气血郁结导致肝郁气滞气滞是本病发生的一个必要条件。因为个体化差异，长期以来对胃癌的辨证分型不尽相同，但存在一定共识。胃癌病机属本虚标实，标实多见于初期，中晚期多见气血衰弱、脏器虚亏等虚象。罗云坚[20]等在将胃癌分为七型：瘀血内阻型、胃热伤阴型、肝胃不和型、痰湿阻胃型、脾胃虚寒型、脾肾阳虚型、气血两虚型。杨金坤[21]将胃癌分为八型：气滞血瘀型、肝胃不和型、痰气交阻型、脾胃气虚型、胃阴不足型、气血双亏型、脾胃虚寒型。郁氏[22]将胃癌分四型：湿热瘀毒型、肝胃不和型、气血双亏型、脾胃虚寒型。张洪基[23]将胃癌分为六型：肝胃不和型、瘀毒内阻型、脾胃虚寒型、痰湿凝结型、胃热伤阴型、气血两亏型。

本研究主要为了探讨胃癌中医分型与化疗敏感性的相关性，采用的是陈锐深教授主编人民卫生出版社2003年出版的的《现代中医肿瘤学》中胃癌辩证分类法，分为肝胃不和型、痰食瘀阻型、脾胃虚寒型、气血亏虚型4型。紫杉类药物的主要作用是使细胞微管蛋白聚合，阻断癌细胞的分裂，从而达到阻碍瘤细胞的生长，其为广谱抗肿瘤药物，且有放疗增敏作用。DDP为含有铂金属络合物，铂原子在DDP分子的作用具有重要的意义，其类似于烷化剂的作用与DNA链中的碱基结合，阻碍DNA复制，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用。5-氟尿嘧啶促使胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，阻断脱氧核糖尿苷酸，从而扰乱肿瘤细胞的DNA合成，主要是阻断其代谢能力，同时氟尿嘧啶也干扰RNA的合成。ADM主要阻碍RNA和DNA的合成，且对于RNA的抑制作用更强，抗瘤谱广泛，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。MMC是从链霉菌中提取，其作用与烷化剂相似，具有三大活性基团氨甲酰、苯醌及乙酰亚胺基，三个基团与与DNA链交联，阻碍DNA的复制的同时对RNA也有抑制作用。临床中许多数胃癌患者发现时已是中晚期，化疗是中晚期胃癌的主要治疗方法之一。在化疗前预测化疗药物是否敏感，实现个体化的化疗，既能提高化疗效果，又能减少化疗药物给患者带来的不良反应。本实验中研究了胃癌患者的中医辩证分型与化疗药物对胃癌细胞的抑制率之间的关系，可以進一步通过肿瘤标记物来进行验证。本研究对胃癌中医证型与胃癌细胞体外化疗药物敏感性的相关性做了简单的探索，不仅仅为了揭示中医证型与肿瘤细胞对化疗药物敏感性是否存在相关性，也为临床合理选择化疗药物提供了依据，为胃癌中西医结合个体化治疗胃癌治疗提供了依据。

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