双侧乳腺癌CA15—3和CK5/6蛋白表达及克隆关系

刘勤 杨伟明　杨雪峰 任宇 苏晓玥 陈梦婷 霍金龙

【摘 要】目的：探讨CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌和单侧乳腺癌的表达特点，分析双侧乳腺癌首发癌和第二癌的克隆关系。方法：收集双侧乳腺癌蜡块标本9例，同时随机选取2012年10例单侧乳腺癌作为对照。运用免疫组化法（Envision法）检测CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌首发癌、第二癌和单侧乳腺癌的表达。结果：双侧乳腺癌首发癌、第二癌和单侧乳腺癌CA15-3的表达率分别8/9（88.9%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。双侧乳腺癌首发癌、第二癌和单侧乳腺癌CK5/6的表达率分别6/9（66.7%）、7/9（77.8%）、8/10（80%）。双侧乳腺癌CA15-3首发癌和第二癌同时阳性有8例。同时阴性0例。双侧乳腺癌CK5/6首发癌和第二癌同时阳性有6例。同时阴性1例。结论：70-90﹪双侧乳腺癌首发癌和第二癌是单克隆关系。

【关键词】双侧乳腺癌；CA15-3；CK5/6

【中图分类号】R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）04-2119-02

原发性双侧乳腺癌左右两侧癌受到类似的激素环境和遗传因素的影响，可能显示出类似的生物学特性[1]。原发性双侧乳腺癌先发生侧为首发癌，后发生侧为第二癌。若同时发现，则肿块大者为首发癌，另一侧为第二癌。第二癌是新发癌即多克隆还是首发癌的转移即单克隆，一直是许多学者研究的热点[2，3]。本研究拟通过观察临床病理类型和CA15-3、CK5/6在双侧乳腺癌和单侧乳腺癌的表达特点及双侧乳腺癌首发癌和第二癌表达的差异，来揭示首发癌和第二癌的克隆关系。

1 材料与方法

1.1 病例选择 收集遵义医学院附属医院2007年1月1日-2013年1月10日共收治双侧乳腺癌9例临床病例资料，同时随机选取2012年10例单侧乳腺癌作为对照，均为女性，所有蜡块组织均经病理科证实为乳腺癌（见图A）。

1.2 临床资料 本组病例双侧乳腺癌发病年龄37岁～54岁，平均年龄45岁，绝经前7例，绝经后2例。9例双侧乳腺癌均有生育史，其中3例有家族史：1例母亲患乳腺癌，1例姐姐患乳腺癌，1例父亲患肝癌。10例单侧乳腺癌发病年龄34-54岁，平均年龄47岁，绝经前3例，绝经后7例，10例单侧乳腺癌患者无家族史。

1.3 病理类型和TNM分期 双侧乳腺癌首发癌中浸润性导管癌7例，浸润性小叶癌1例，导管内癌1例。第二癌浸润性导管癌 4例，浸润性小叶癌2例，原位癌3例。9例双侧乳腺癌首发癌和第二癌TNM分期为0期或Ⅰ期：首发癌9例为Ⅰ期，第二癌6例Ⅰ期，3例0期。9例双侧乳腺癌中，首发癌和第二癌在病理类型有6例表现出一致性，TNM分期上表现出一致性[4]，并且两侧癌中都已浸润性导管癌为主（见表1）。

1.4 检测方法和试剂 所有病例标本均经10% 福尔马林溶液固定， 常规石蜡包埋， 连续4μm 厚切片， 行Envision法免疫组化染色：二甲苯梯度脱蜡两次，每次10min，乙醇梯度水化，3%双氧水浸泡10min去除内源性过氧化酶，CA15-3柠檬酸修复，CK5/6EDTA微波修复抗原，自然冷却后PBS液冲洗3次，每次两分钟，滴加牛血清封闭液封闭45分钟，加一抗室温放置一小时，再次PBS液冲洗三次，每次两分钟，滴加二抗，室温放置15min，最后PBS液冲洗3次，每次两分钟。DAB显色，苏木素复染细胞核，乙醇梯度脱水，透明，中性树胶封片。鼠抗人乳腺癌相关抗原（CA15-3） 单克隆抗体（工作液浓度 1︰100）和鼠抗人CK5/6单克隆抗体（工作液浓度 1︰100）均购自北京中杉金桥公司。二抗试剂盒购于美国基因公司。CA15-3用已知阳性的乳腺癌组织切片做阳性对照（见图B），CK5/6用正常皮肤组织切片做阳性对照（见图C），以PBS 代替一抗做阴性对照（见图D）。

1.5 结果判断 CA15-3阳性染色部位为细胞膜或细胞浆（见图E-G），CK5/6阳性染色部位为细胞浆（见图H-J）。以染色部位出现棕黄色或棕褐色为阳性表达，每张切片选取10个不同部位，400倍视野进行拍摄。参照许良中等的方法[5]每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别评分0、1、2、3 分。根据阳性细胞在所观察细胞（ 100 个） 中所占比例评分：阳性细胞数< 5% 为0 分，6% ～ 25% 为1 分，25% ～ 50% 为2 分，> 50%为3 分。然后根据两项评分之和判断其结果： 0 分为（ - ） ， 2 分为（ +） ， 3～4 分为（ ++） ， 5～6 分为（ +++） 。（ - ） 为表达阴性； （ +） 为低表达； （ ++） ～（ +++）为高表达。

2 结果

2.1 CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌的表达 CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌的表达：免疫组化结果显示：CA15-3表达于乳腺癌细胞的细胞膜或细胞浆，以细胞膜或细胞浆出现棕黄色或棕褐色网格状阳性染色为主。CK5/6表达于乳腺癌细胞的细胞浆，以细胞浆染成棕黄色或棕褐色网格状为阳性表达。双侧乳腺癌首发癌和第二癌CA15-3表达同时阳性有8例。同时阴性0例。原发性双侧乳腺癌首发癌和第二癌CK5/6表达同时阳性有6例。同时阴性1例。

注：A：乳腺癌组织HE染色；B：CA15-3阳性对照图；C：CK5/6阳性对照图；D：PBS代替一抗阴性对照图；E： CA15-3在双侧乳腺癌首發癌的阳性表达；F：CA15-3在双侧乳腺癌第二癌的阳性表达；G：CA15-3在单侧乳腺癌的阳性表达；H：CK5/6在双侧乳腺癌首发癌的阳性表达；I：CK5/6在双侧乳腺癌第二癌的阳性表达；J：CK5/6在单侧乳腺癌的阳性表达

图1 图A为乳腺癌组织HE染色，×400 图B-J免疫组化法（Envision法），×400

2.2 CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌和单侧乳腺癌的表达

双侧乳腺癌首发癌和第二癌CA15-3表达同时阳性有8例。同时阴性0例。双侧乳腺癌首发癌和第二癌CK5/6表达同时阳性有6例。同时阴性1例。CA15-3和CK5/6在10例单侧乳腺癌的表达率分别为9/10（90%）和8/10（80%）可见双侧乳腺癌首发癌和第二癌绝大多数CA15-3和CK5/6的蛋白表达一致，并且与单侧乳腺癌的表达没有明显差别。即双侧乳腺癌的两侧癌可能来源于同一乳腺癌干祖细胞。

3 讨论

肿瘤标志物是继影像学诊断和病理诊断之后最常用的肿瘤诊断方法之一。CA15-3为癌抗原，是乳腺细胞上皮表面糖蛋白变异体，对乳腺癌有明显的器官特异性，对乳腺癌的早期诊断和术后疗效检测均有十分重要的临床价值。是监测乳腺癌患者术后复发的最佳指标，其含量变化与治疗结果相关[6]。细胞角蛋白（CKs）来源于上皮组织，由20个成员组成，CK5/6是其中的一个成员，是一种基底细胞型角蛋白[7]。CK5/6是表达与basal-like表型乳腺癌中的一个特征性标志物，是乳腺癌独立的预后指标[8]。用CA15-3和CK5/6联合检测原发性双侧乳腺癌首发癌和第二癌的表达差异，更具有临床研究意义。

乳腺癌是一个成对的器官容易受到相同的环境和激素的影响。乳腺可以比作一对“双胞胎”。关于双胞胎的研究是假定单卵双胎是完全一样的，在单卵双胎和异卵双胎之间比较一些特征和疾病的一致性首先要承认遗传因素和环境因素的影响[8]。本实验研究表明，大部分原发性双侧乳腺癌是在绝经前发病，通过运用免疫组化来检测左右两癌的蛋白表达差异。表明原发性双侧乳腺癌首发癌和第二癌CA15-3和CK5/6的表达相似，说明两癌可能来源于同一乳腺癌干祖细胞。原发性双侧乳腺癌首发癌和单侧乳腺癌之间的蛋白表达亦无差异，表明CA15-3和CK5/6在双侧乳腺癌和单侧乳腺癌的表达无区别，双侧乳腺癌的恶性程度和单侧乳腺癌的恶性程度相似。虽然乳腺是成对器官，但乳腺的成长来自各自的原始乳芽。在成长过程中双侧乳腺易受到类似的遗传因素、环境因素和激素的影响。有蛋白表达就一定有相应的基因，而有基因不一定存在蛋白表达。左右两侧乳腺癌蛋白表达相似，应该有相同的基因，进一步表明两个癌灶可能来源于同一癌细胞。

我们的研究表明70-90﹪双侧乳腺癌左右两侧癌有一致病理类型和蛋白表型特征，说明双侧乳腺癌的首发癌和第二癌是单克隆来源。而有极少部分表型不一致，可能是因为在癌灶的生长过程中发生了基因突变，从而导致蛋白表达有相差性。因此，我们接下的研究是从组织中提取RNA，逆转录成CDNA，经上下游引物扩增需要的产物并测序，分析CA15-3和CK5/6基因在双侧乳腺癌左右两癌有无相同的突变位点。

参考文献

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[5] 袁雪芹，荊福祥，袁雪英.CK5 /6、p63 在乳腺良恶性病变鉴别诊断中的意义[J].吉林医学，2011，（32）16：3208-3210.

[6] 耿翠芝.与乳腺癌相关的肿瘤标志物研究现状及评价[J].中华乳腺病杂志（电子版），2009，3（1）：9-15.

[7] 毕晓峰，高纪东，宣立学.应用组织芯片研究乳腺癌中CK5/6蛋白的表达及临床意义.山东大学学报（医学版），2008，46（6）：502-5

[8] Rakha EA，E1-Saved ME，Green AR，et al.breast carcinoma with basal differentiation：aproposal for pathology definition based on basalcytokeratiexpression [J].Histopathology.2007 Mar；50（4）：434-8.

作者简介：

刘勤，男，住院医师，1982年12月01日 硕士学位 目前主要从事临床甲状腺乳腺外科 研究方向为乳腺癌。

杨伟明，男，三级教授，主任医师 学士学位 主要从事临床甲状腺乳腺工作，研究方向为乳腺癌。