咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质纹状体自噬及自噬相关蛋白表达的影响☆

刘斌 孙静 张晋霞 马原源 毛文静 吕超男 成晓华 李世英

咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质纹状体自噬及自噬相关蛋白表达的影响☆

刘斌*孙静*张晋霞*马原源*毛文静*吕超男*成晓华*李世英*

目的 观察咪多吡对帕金森病（Parkinson disease，PD）模型大鼠黑质纹状体自噬及自噬相关蛋白Beclin1和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPlLC3，简称LC3)的表达的影响，探讨咪多吡治疗帕金森病的作用机制。方法72只健康SD大鼠随机分为假手术组（n=24）、帕金森病模型组（模型组n=24）和咪多吡治疗组（咪多吡组n=24），每组又分为模型制备后4 d、8 d两个亚组（每个亚组n=12）。采用颈背部皮下注射鱼藤酮制作帕金森病模型，免疫组化法和Western blotting法检测黑质纹状体自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠黑质纹状体中Beclin1、LC3蛋白表达和LC3II/LC3I比值增多（均P＜0.05），8 d组高于4 d组（均P＜0.05）。与模型组比较，咪多吡组黑质纹状体中Beclin1、LC3蛋白表达和LC3II/LC3I比值降低（均P＜0.01），8 d组低于4 d组（均P＜0.05）。结论咪多吡可能通过抑制大鼠PD模型黑质纹状体神经细胞自噬，发挥对帕金森病的治疗作用。

帕金森病 咪多吡 自噬 LC3 Beclin1

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人常见的慢性进行性神经系统退行性疾病，以中脑黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性变性和丢失为主要病理特征，但其病因及确切的发病机制目前尚未明确。近年来自噬及自噬溶酶体途径在神经变性疾病中的作用越来越受到关注[1]，有研究发现自噬（autophagy）过度激活可能导致神经细胞死亡，与帕金森病发病密切相关[2]，并且在帕金森病患者的标本和毒物诱导的体外模型中，均发现自噬参与PD的发病[3]。单胺氧化酶B（monoamine oxidase B,MAO-B）抑制剂具有神经保护作用[4-5]，能专一性抑制多巴胺分解，维持脑内多巴胺水平[6]，延缓PD患者症状的发展。咪多吡（eldepryl）是一种常用的MAO-B抑制剂，能保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害而阻止PD进展[7]，但具体作用机制尚不明确。本研究采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病模型大鼠，观察咪多吡对帕金森病（PD）模型大鼠黑质纹状体自噬及自噬相关蛋白Beclin1及微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAPlLC3，简称LC3）的表达的影响，探讨咪多吡治疗帕金森病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，体质量250～300g，由北京华阜康生物科技股份有限公司供给，合格证号SCXK(京) 2013-0013。在河北联合大学屏障环境动物实验室自由进食喂养，室温控制在23±2℃，自然光照，实验前适应喂养2周。随机分为：假手术组（n= 24）、帕金森病模型组（模型组，n=24）和咪多吡治疗组（咪多吡组，n=24）。每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组（n=12）。

1.2 帕金森病模型制备采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备大鼠帕金森病模型[8]。具体操作方法：鱼藤酮以葵花油溶解配制成2mg/mL鱼藤酮葵花油乳液，充分震荡混匀后避光保存。模型组和咪多吡组大鼠称重以后以鱼藤酮2mg/kg体重计算鱼藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠颈背部皮肤，用1 mL注射器皮下注射鱼藤酮葵花油乳液，每日早8: 00～9:00注射一次，连续注射6～8周，直到出现明显行为学评分，即模型制备成功。假手术组以同种方法每日葵花油皮下注射。

行为学评分：将大鼠行为变化分6个等级记分[9]：1分，大鼠出现拒捕行为减弱、竖毛、毛色变黄变脏、弓背、主动活动减少；2分，有1分的表现，且主动活动减少明显、动作迟缓，并有震颤，或有步态不稳；4分，有2分的表现，且步态不稳，或不能直线行走、或行步时向一侧旋转；6分，向单侧斜卧，单侧前肢和/或后肢瘫痪，行走困难、进食困难；8分，单侧，前肢和/或后肢完全瘫痪，四肢拘挛，体重大幅度减轻，不能进食；10分，濒死状态或死亡。本实验选取评分2～6分的大鼠作为PD模型大鼠。

1.3 给药方法假手术组：连续颈背部皮下注射葵花油2mg/kg，待模型制备成功后停止皮下注射，并灌胃给生理盐水。模型组：连续颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳液2mg/kg，待模型制备成功后停止皮下注射，并灌胃给生理盐水。咪多吡组：模型制备成功后，每日灌胃给咪多吡（orion corporation espoo，Finland）0.5mg/kg，分别连续给药4 d和8 d。

1.4 标本制备免疫组化法：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后暴露心脏，经左心室快速灌注盐水100mL，持续灌注4%多聚甲醛-PBS 100mL，断头取脑，4%多聚甲醛-PBS固定过夜，冠状面切断包含黑质的脑组织(前囟尾侧4.6～6.2mm)，石蜡包埋，5µm连续切片，在显微镜下观察组织微观结构变化。

Western-blotting法：用10%水合氯醛（0.3mL/ 100 g）对大鼠进行深度麻醉。断头后于冰上开颅取脑，用冷的PBS漂洗残余血，立即分离出新鲜纹状体，将纹状体组织置于15mL离心管中，组织匀浆机12000转/分匀浆15 s，加入4℃预冷的组织裂解液，振荡混匀，4℃作用30min，细胞悬液4℃低温离心12000转/分离心10min，留取上清液4℃保存。经蛋白定量后分装，用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solutin PBS)调蛋白浓度到一致（750μg/mL），加入等体积的上样缓冲液，沸水中煮至少5min。

1.5 免疫组化法检测大鼠黑质纹状体Beclin1、LC3水平取制备好的组织标本，加入正常羊血清封闭液中，先后滴加一抗4℃过夜、滴加二抗和适量辣根酶标记链霉卵白素工作液，进行DAB显色。免疫组化法具体操作步骤严格按试剂说明书操作要求进行。Beclin1、LC3免疫组化阳性标准：光学显微镜下，胞浆呈棕黄色，核呈浅蓝色或紫蓝色。组织切片采用OLYMPUS摄像显微镜（400×）摄像，选择各组大鼠黑质不重叠的6个视野，应用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统进行Beclin1、LC3阳性细胞计数。

1.6 Western blotting法检测大鼠黑质纹状体Beclin1、LC3水平等量蛋白样品（每个泳道50µg）经l0%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE）电泳分离后，以湿转法电转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride PVDF）膜上。转移缓冲液（甘氨酸5.8g，Tris 2.9g，SDS 0.37 g，800mL重蒸馏水溶解后加入200mL甲醇）。转移后的PVDF膜放入封闭液中封闭，然后加入稀释好的一抗（1:1000）4℃孵育过夜。PBS洗膜，加人相应稀释好的二抗（羊抗兔，1:2000），37℃反应1 h，洗膜，以ECL显色，胶片曝光显影，结果用Image J软件分析。

1.7 统计学方法所得数据以（±s）表示，用SPSS13.0统计软件进行数据分析。两组数据间比较采用t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 各组大鼠Beclin1、LC3蛋白免疫组化检测结果假手术组大鼠黑质纹状体中Beclin1和LC3阳性细胞的表达较低。与假手术组比较，模型组大鼠黑质纹状体中Beclin1、LC3蛋白表达增多（均P＜0.01），8 d组高于4 d组（均P＜0.05）。与模型组比较，咪多吡组黑质纹状体中Beclin1、LC3蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），8 d组低于4 d组（均P＜0.05）（见表1和图1-2）。

表1 各组大鼠黑质纹状体Beclin1、Lc3阳性细胞数（个/高倍视野）

图1 各组大鼠黑质Beclin1免疫组化结果（400×）A：对照组4 d；B：对照组8 d；C：模型组4 d；D：模型组8 d；E：咪多吡组4 d；F：咪多吡组8 d

图2 各组大鼠黑质LC3免疫组化结果（400×）A对照组4 d；B对照组8 d；C模型组4 d；D模型组8 d；E咪多吡组4 d；F咪多吡组8 d

3.2 各组大鼠Beclin1、LC3II/LC3IW estern blotting检测结果假手术组大鼠黑质纹状体中Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I比值较低。与假手术组比较，模型组大鼠黑质纹状体中Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I比值增多（均P＜0.01），8 d组高于4 d组（均P＜0.05）。与模型组比较，咪多吡组黑质纹状体中Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I比值降低（P＜0.05，P＜0.01），8d组低于4 d组（均P＜0.05）。（见表2和图3）。

4 讨论

采用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制备帕金森病动物模型，能较好地模拟帕金森病的慢性进行性自然病程和发病特点，是目前国内外公认的理想的帕金森病动物模型之一[10-11]。本实验结果显示造模后大鼠出现震颤、僵直、运动减少，活动迟缓，行步时向一侧旋转等行为学改变，说明我们的造模是成功的。

表2 各组大鼠黑质纹状体Beclin1、LC3II/LC3I表达

图3 Western blotting结果A：纹黑质状体Beclin1蛋白；B：纹黑质状体微管相关蛋白l轻链3(LC3II/LC3I)

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程[12]。一方面自噬的启动可能有助于维持神经元稳态，减少继发损伤[13]，另一方面自噬过度激活可能导致神经细胞死亡，加速神经元变性的进展[14]。有研究表明自噬失调在PD的致病进程中发挥关键作用[3]。Beclinl作为自噬的重要基因之一，是调控自噬的关键因子[15]，上调Beclin1表达能够促进自噬活性的增高[16]。LC3是在高等真核细胞中发现的第1种自噬体膜蛋白，是自噬的关键蛋白，参与自噬体的形成。LC3分为I型和II型，在自噬发生过程中，I型LC3经泛素样加工修饰，与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成II型LC3并聚集到自噬体膜上，其含量的多少与自噬体数量的多少呈正相关[17]。咪多吡（Eldepryl）是一种选择性的单胺氧化酶B抑制剂，不仅能增加抗氧化酶的浓度、减轻细胞凋亡，还可以产生神经营养因子，如神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质细胞系来源的神经营养因子，能保护黑质细胞免于各种神经毒素的侵害[6,18]，可阻止PD进展。本研究的免疫组化法和Western blotting法检测结果均显示，帕金森病模型组大鼠黑质纹状体中Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I比值明显增加，且随时间延长有上升趋势，结果说明自噬参与了帕金森病的发病、发展过程，而咪多吡治疗组黑质纹状体中Beclin1蛋白表达和LC3II/LC3I比值降低，且8 d组低于4 d组，说明咪多吡可以抑制PD模型大鼠黑质纹状体神经细胞自噬及自噬相关蛋白，随着时间的延长，作用更明显。由上述研究结果可推测，咪多吡可能通过抑制PD模型大鼠黑质纹状体神经细胞自噬，发挥对帕金森病的治疗作用。

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Effects of Eldepryl on autophagy and autophagy-related protein in substantia nigra and striatum in rats with Parkinson's disease.

LIU Bin,SUN Jing,ZHANG Jinxia,MA Yuanyuan,MAO Wenjing,LV Chaonan, CHENG Xiaohua,LI Shiying.
First Department of Neurology,the Affiliated Hospital of HebeiUnited University,Tangshan 063000,China.Tel:0315-3725963.

ObjectiveTo examine the effects of eldeprylon autophagy and autophagy-related proteins such as Beclin1 and LC3 in the substantia nigra and striatum in a ratmodel of Parkinson disease(PD).MethodsA total of 72 SD ratswere random ly divided into sham-operated group（n=24）,PD model group（n=24）and Eldepryl treatmentgroup（n= 24）.Each group was further divided into 4 d and 8 d subgroups following the establishment of P Dmodel.Themodel of PD was established by subcutaneous injection of rotenone in rats.The expression of Beclin1and LC3 in the substantia nigra and striatum was detected by using immunohistochemistry and western blotting.ResultsThe expression levels of Beclin1,LC3 and LC3II/LC3I in the substantia nigra and striatum were increased in themodel group than in the sham operation group(all P＜0.05).The increase in expression of Beclin1,LC3 and LC3II/LC3Iwasmore obvious at8 d than at 4 d group(all P＜0.05).The expression levels of Beclin1,LC3 and LC3II/LC3Iin the substantia nigra and striatum were reduced in the eldepryl treatmentgroup than in themodel group(all P＜0.01).The expression levels of Beclin1,LC3 and LC3II/LC3Iwere significantly lower at8 d than at4 d groups(all P＜0.05)in eldepryl treatment group.ConclusionsEldepryl can protectagainst PD through inhibition of autophagy in the substantia nigra and striatum in rats.

Parkinson disease Eldepryl Autophagy LC3 Beclin1

R742.5

A

2014-03-12）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.003

☆河北省医学科学研究重点课题（编号：20130064）

*河北联合大学附属医院神经内一科（唐山 063000）