UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S测定缓解体力疲劳类保健品中非法添加的化学物质

张圆 郝刚 闵春艳 吴杨 袁灿阳 顾炳仁

（1苏州市食品药品检验所，江苏苏州 215104；2江阴市利港医院，江阴 214444）

UPLC-DAD-Q-TO F-M S/M S测定缓解体力疲劳类保健品中非法添加的化学物质

张圆1郝刚1闵春艳1吴杨1袁灿阳2顾炳仁1

（1苏州市食品药品检验所，江苏苏州 215104；2江阴市利港医院，江阴 214444）

目的：利用超高效液相-串联四级杆-飞行时间液质联用系统（UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS），建立快速可靠灵敏的测定缓解体力疲劳类保健食品中违法添加西地那非、他达拉非、伐地那非、红地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、伪伐地那非、硫代艾地那非、那红地那非和育亨宾等12种化学药品的液质联用检测方法。方法：采用UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS液质联用仪，以Agilent ZORBAX Eclipse plus C18为色谱柱；以0.1%甲酸-0.01 mol/L乙酸铵水溶液和甲醇梯度洗脱，流速为0.3 m L/min；ESI正离子模式，一级、二级质谱全扫描，进行UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS的定性及定量分析。结果：经方法学验证，本方法在2～80 μg/m L浓度范围内线性良好、精密度（RSD%）小于2%、回收率在80.5%～98.7%之间。结论：本方法快速、准确、灵敏度高、分离度高，为快速筛查缓解体力疲劳类保健食品中非法添加化学物质提供有力工具。

超高效液相-串联四级杆-飞行时间液质联用仪；缓解体力疲劳；非法添加的化学物质

治疗男性性功能障碍的各种选择性磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂类药物层出不穷，该类药物对并发心血管系统疾病和糖尿病患者有严重不良反应，故须在医生指导下使用。由于补肾壮阳类药物的高额利润，加之其合成路线早已不是秘密，因此，一些不法分子为牟取暴利，非法添加此类化学成分进入保健食品，宣称具有补肾壮阳功效[1]。西地那非已成为中国保健品市场最常见的非法添加药物[2]。缓解体力疲劳类保健品中非法添加PDE-5抑制剂会蒙蔽该类药物有针对性的使用群体和适宜剂量，以“短暂的好转”带来“巨大的副作用”。本研究旨在为打击非法添加化学物质开发专属性强，灵敏度高的快筛快检的方法。

目前，国内外致力于采用多种方法打击缓解体力疲劳类保健食品中非法添加的PDE-5抑制剂的行为。高效液相色谱法（HPLC），气相色谱（GC）-质谱（MS），液相色谱（LC）-质谱（MS），核磁共振扫描（NMR），离子迁移谱，LC-三重串联四级杆（QQQ），LC-傅里叶变换红外光谱（FTIR）-MS，超高效液相色谱（UPLC）-飞行时间（TOF）-MS，红外等手段广泛用于PDE-5抑制剂的筛查和鉴定[3-12]。日前国家食品药品监督管理总局发布了1个药品检验补充检验方法和检验项目批准件（编号2009030），对缓解体力疲劳类（补肾壮阳类）保健食品和中成药进行非法添加化学药品的筛查和验证，包括11种化学药品，一个分析周期耗时45 m in。

本研究利用UPLC快速高效分离分析的特点，结合四级杆（Q）-TOF高分辨质量分辨的能力，具有极高的选择性，为保健食品中非法添加化学物质的筛查和检测提供了强有力的工具，实现了高灵敏度和高通量的结合。

1 实验材料

1.1 仪器和试剂

美国安捷伦公司1290 Infinity-6538-Q-TOF超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用仪；ML204电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；M illipore公司M illi-Q纯水仪。Q-TOF定性软件：Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.05.00 Build 5.0.519.13。PCDL软件：Mass Hunter PCDL Manager Version B.04.00 Build 92.0。

甲醇，MERCK公司，LC-MS级；乙酸铵，SIGMAALDRICH公司，LC-MS级；水为M illi-Q纯水仪制去离子水。

1.2 对照品与样品

西地那非、他达拉非、伐地那非、红地那非、豪莫西地那非、羟基豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、伪伐地那非、硫代艾地那非、那红地那非和育亨宾12种对照品均来自TORONTO RESEARCH CHEM ICALS INC，纯度大于99%。

8批样品均来自于各市食品药品监督管理局市场抽样。

2 实验步骤

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱；DAD（二极管阵列）检测器，检测波长230 nm；扫描波长范围190～400 nm，步长（step）：2 nm。流动相：0.1%甲酸-10 mmol乙酸铵水溶液（A）、甲醇（B），流速：0.3 m L/m in；柱温：30℃。进样体积：1 μL。洗脱梯度：时间（m in）/B（%）：0 m in 10%，5 min 50%，9 m in 50%，13 m in 70%，15m in 70%，20min 95%。12种对照品的色谱分离情况见图1。

图1 12种对照品的混标一级提取离子流（EIC）色谱叠加图

2.2 质谱条件

电喷雾离子化源（ESI）；毛细管温度350℃；干燥气流量10 L/m in；雾化气压力40 psi；喷雾电压3 500 V；碎裂电压（fragmentor）电压135 V；正离子检测方式；扫描方式为全扫描一级质谱、全扫描二级质谱。12种缓解体力疲劳类保健食品非法添加化学物质的分子式、准分子离子精密质量、碰撞能量和碎片离子信息如表1所示。

2.3 对照品溶液的制备

精密称定12种对照品各约5 mg，分别置10 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为单标储备液。再分别取1 m L单标置同一50 m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成含上述各对照品10 μg/m L的混合标样，供进样分析用。

2.4 供试品溶液的制备

若供试品为固体制剂，精密称取一次服用量，研细后转移至10 m L量瓶中，加甲醇约8 m L，超声处理15 m in，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，取适量上清液，10 000 rpm离心5 min，取上清液100 μL用甲醇稀释至1 m L，即得。

若供试品为液体制剂，精密量取2 m L，置10 m L量瓶中，加甲醇约8 m L，振摇3 min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。量取续滤液适量于离心管中，10 000 rpm离心5 m in，取上清液100 μL用甲醇稀释至1 m L，即得。

表1 12种非法添加化学物质分子式、准分子离子精密质量、碰撞能量和碎片离子

由于供试品检测前的浓度未知，故若其检测浓度超出方法的线性范围，则用甲醇进行稀释，以稀释后溶液进行定量。

3 方法学验证

按照上述实验步骤，对方法的专属性、线性范围和检出限、精密度、准确度进行了考察。对照品储备液稀释后按上述液质联用条件测定，按信噪比S/N=3计算各化合物的检出限，各成分检出限在2.170～53.57 ng/m L。取同一浓度混合对照品溶液，连续进样6次，计算一级EIC图谱中峰面积相对标准偏差，以评价精密度。取12种对照品混标溶液，分别稀释，配制成含12种对照品各2，5，10，20，50，80 μg/m L的标准曲线工作溶液，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归。取阴性样品1次服用量的内容物6份，分别加入一定量对照品，按样品处理方法同法处理测定回收率。测定结果见表2。

表2 12种非法添加化学物质的线性方程、相关系数和检出限

4 样品测定

将市场上抽查的8批样品，按照2.4方法处理样品，并用UPLC-二极管阵列检测（DAD）-Q-TOF-MS/MS处理样品。比较样品和对照品的一级、二级质谱扫描图，结合DAD光谱图，判断样品中是否含有非法添加物质。结果如表3所示，在8种样品中3批检出阳性。

5 讨论

5.1 色谱条件的优化

在12个PDE-5抑制剂对照品中，豪莫西地那非和伐地那非、伪伐地那非和那莫西地那非分别为两组分子式相同的物质，其准分子离子[M＋H]+的精密质量也相同，故必须在液相色谱上完全分离，本实验对流动相梯度和比例进行不断优化，最终使得精密质量相同的组分完全分离。各化合物的保留时间均大于5 m in，尽量避免因复杂基质影响而产生假阳性现象。

5.2 胶囊壳的测定

由于某些非法商家在胶囊壳中添加抗疲劳类药物，所以胶囊壳中非法添加化学物质的测定很有必要。其测定方法为将胶囊内容物取出后，取一定量的胶囊壳按照2.4进行同法处理。4批胶囊壳均未检出非法添加物。

表3 8批样品信息及测定结果

5.3 不同溶剂处理样品对实验影响的研究

本实验考察了甲醇和乙腈作为提取溶剂对测得结果的影响，结果表明，不同提取溶剂对实验结果无显著影响。

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Detection of Illegally Added Chem icals in Anti-fatigue Health Foods by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS M ethod

Zhang Yuan1，Hao Gang1，M in Chunyan1，Wu Yang1，Yuan Canyang2，Gu Bingren1（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215000，China；2 Ligang Hospital of Jiangyin City，Jiangyin 214444）

Objective:To establish a fast，accurate and sensitive method by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS for the detection of 12 kinds of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods，such as sildenafil，tadalafil，vardenafil，acetildenafil，homosildenafil，hydorxyhomosildenafil，norneosildenafil，am inotadalafil，pseudovardenafil，thioaildenafil. noracetildenafil，and yohimbine.Methods:Agilent ZORBAX Eclipse plus C18analysis column was used with mobile phase of 0.01 mol/L ammonium acetate aqueous solution（containing 0.1%form ic acid）-methanol and gradient elution，the flow rate was 0.3m L/m in.ESI+scan and MS/MS mode were taken.Qualitative and quantitative analyses were carried out by UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS.Results:The method was validated.A good linear relationship was showed in the concentration of 2～80 μg/m L，（RSD＜2%）and the recovery was obtained in range of 80.5%～98.7%.Conclusion：This method is fast，accurate and sensitive with a high degree of separation，it can be used as a powerful tool for the fast detection of illegally added chemicals in anti-fatigue health foods.

UPLC-DAD-Q-TOF-MS/MS；Anti-Fatigue Preparations；Illegally Added Chemicals

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.08.004

2014-07-07）

苏州市科学技术局科学计划项目（SS201220）

张圆，女，硕士。研究方向：药物分析。E-mail：zhangyuan213@sina.com

顾炳仁，男，硕士生导师。研究方向：药物分析。通讯作者E-mail：944757490@qq.com