犬瘟热病毒检测技术的研究进展

李忠生 王智群 冯秀娟

犬瘟热病毒检测技术的研究进展

李忠生 王智群 冯秀娟

犬瘟热（CDV）在1809年由Jeneer首次报道。1905年卡尔（Carre）将分离的滤过性致病因子接种动物从而复制出病例，1926年Laidlaw和Duncan利用完全隔离的犬和易感性高的雪貂进行了人工感染，该试验肯定了本病的病原为病毒。1980年我国首次分离并获得了犬瘟热病毒。犬瘟热常引起大批犬、貂、狐等动物发病，死亡率可达30～80%，继发细菌感染是导致死亡率增高的主要原因之一,若并发肺炎其死亡率可高达90%以上。国内外对CDV进行了大量研究, 建立了多种实验室检测方法。下面我们从病毒分离、免疫学和分子生物学等方面对犬瘟热病毒检测技术进行阐述。

一、病毒的分离鉴定

病毒的分离培养是确诊犬瘟热最根本的诊断方法。但由于CDV对外界环境的抵抗力弱，致使病毒的分离成功率很低，此外病毒分离成功率还与分离病毒的细胞、动物的抗体水平、病料采样的时间部位、样品处理方法等因素有关。目前培养CDV的细胞有原代培养细胞和传代细胞系两类。原代培养细胞主要有犬或貂的肺巨噬细胞、鸡胚成纤维细胞（CEF）、犬肾原细胞、牛胚胎肺细胞、犬脑细胞（DB）等；细胞系有犬肾细胞系（MDCK）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）、猫肾细胞系（CRFK）、猫胚胎细胞系（FE）等。有报道称能够表达犬淋巴细胞激活信号分子的细胞，对分离CDV非常有效，在感染细胞1天后即可检测到病毒，极大地减少传统分离方法的耗费。病料可采用急性病例的胸腺、脾、肝、肺、淋巴结，发病早期的病例可采淋巴组织，有脑炎症状的病例可采小脑等。

病毒鉴定可采用电子显微镜对病毒粒子形态学进行观察，也可以采用常规方法进行病毒理化试验，还可以进行动物回归试验，观察是否有犬瘟热症状。

二、免疫学检查方法

（一）琼脂免疫扩散试验

琼脂免疫扩散试验只能粗略地对抗体进行测定，灵敏性略差，因为不需要使用特殊仪器且容易操作，较适合在基层应用。任文陟等用病死貉肝脏为抗原，以犬瘟热鸡胚成纤维细胞弱毒疫苗免疫绵羊制备琼脂扩散抗体，建立了琼脂扩散试验方法。该方法与电镜检查结果总符合率为90%。

（二）SPA协同凝集试验

SPA协同凝集试验主要用于感染犬瘟热动物血清中抗体的检测，具有快速、特异、易于操作、样品可长期保存等优点，易于推广。刘鼎新等采用这种方法和琼扩试验分别对临床疑似犬瘟热的病犬进行检测，结果表明两种方法结果一致。刘润珍等制备了犬瘟热快速诊断试剂，并确定了制备工艺及标准操作程序，3～5 min内即可获得诊断结果。利用粪便和尿液检查抗原不受疫苗接种的干扰。

（三）免疫组化技术

免疫组化技术主要用于犬瘟热的死后诊断，因其能检测CDV在各组织脏器的分布情况，可以为检测样品的筛选提供依据，但其需要特异的抗体结合反应。本法不须用荧光显微镜、标本可以长期保存，这些都是优于荧光抗体法之处。显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB显色液呈棕黄色，还可用常规染料作反衬染色，细胞结构更清晰，有利于抗原的定位。遇秀玲等采用免疫组化间接BA法，对疑似CD的病犬脏器组织中的抗原进行了定位检查和系统病理学观察，结果表明病犬的多个组织器官均可见抗原阳性反应。Gathumbi等认为该方法也可用于石蜡包埋的组织、福尔马林固定或培养物中CDV的组织学检测。

（四）免疫荧光技术

免疫荧光技术是指用荧光素标记抗原或抗体，用荧光显微镜观察荧光以示踪相应的抗原或抗体的方法。本方法具有反应特异性、染色快速等特点，可在细胞水平上进行抗原定位，是目前国际通用的诊断CDV的公认手段。

Coffin等建立免疫荧光方法来诊断犬瘟热，认为该方法可促进犬瘟热的特异性诊断，但是需要特殊设备，且通常需要在专门的试验室中进行。在试验室中可用直接或间接荧光素标记的CDV抗体染色，并用荧光显微镜进行检查。

（五）血清中和试验

中和试验是根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，敏感性高、特异性强，是诊断CD、评价CD疫苗免疫效果、监测免疫犬抗体水平的标准方法。Appel等利用微量血清中和试验对样品进行检测，发现此方法具有很高的敏感性和特异性。血清中和试验虽然有很多优点，但试验所需时间较长，工作量大，通常需几天，因此不利于CDV快速诊断。

（六）酶联免疫吸附试验

目前ELISA是已用于感染犬血清和脑脊液中病毒性抗原的检测。其过程是将抗原（或抗体）吸附于固相载体上，然后进行免疫酶反应，底物显色后用分光光度计或肉眼判断结果。ELISA方法包括间接法、夹心法、双抗体夹心法、竞争法等，该方法具有快速、灵敏、简便的特点，在CD的流行病学调查和CD的免疫情况评估工作中常用到该方法，尤其适合规模很大的样品的检测。Blixenkrone-Moller等建立了检测抗犬瘟热病毒IgM的ELISA，用于犬和水貂CDV早期感染的检测。传统的ELISA方法用犬瘟热病毒细胞培养物做包被抗原，CDV在细胞上繁殖量低而且抗原提纯难度较大，用基因技术有望解决这一难题。简中友等用重组N蛋白作为包被抗原建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法，并与进口诊断试剂盒比较，符合率分别为92.4%、97.1%。为免疫犬群抗体检测、CDV的早期诊断和CDV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

（七）免疫胶体金技术

1971年，Faulk和Taylon将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用免疫胶体金标记技术研究沙门氏菌壁细胞抗原成分，首次将胶体金标记技术引入免疫化学。此后，胶体金作为新型免疫标记技术快速发展，许多学者进一步证实胶体金稳定又能迅速吸附蛋白质，可以作为探针精确定位细胞表面及细胞内蛋白质、核酸、激素、抗原等生物大分子。进入20世纪90年代初期，免疫胶体金又与固相膜结合发展了以膜为固相载体的免疫胶体金快速诊断技术，它是当前快速敏感的免疫检测技术之一，具有巨大的发展潜力和应用前景。

胶体金标记抗体实质是抗体被胶体金颗粒吸附到表面的过程，这种吸附属于物理性吸附，对抗体生物活性影响很小，容易获得较高的标记率；而胶体金不属于生物活性物质，大大减少了干扰检测结果的因素。胶体金免疫层析技术是用于肉眼水平的免疫检测，具有试剂和样本用量小、肉眼易判断、携带方便、敏感度和特异性高、结果可长期保存、不需特殊设备等优点，适用于现场大量样本的检测。用胶体金标记抗CDV的单克隆抗体，然后与样品中的CDV结合，形成双抗体夹心结构，呈现出肉眼可见的红色条带。该法灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，结果准确、易于判读。

三、分子生物学诊断方法

分子生物学的发展为犬瘟热的研究开辟了新的途径，并提供了多种新的检测方法和手段，CDV致病机理、分子病毒学以及免疫学等许多相关研究得以迅速的发展，其中分子生物学诊断技术研究也得到快速的发展，但这些诊断方法尚处在试验室阶段。利用分子生物学技术克隆表达CDV主要的结构和功能蛋白，尽快研制出特异性诊断抗原或特异核酸探针，对本病的诊断有重要意义，该技术将来有着广阔的前景和发展潜力。

（一）核酸杂交技术

核酸分子杂交技术是将具有互补核苷酸序列的两条单股核酸分子放入同一反应体系中，两条互补链重新缔合成双链。该技术也是一种分子杂交技术，是免疫学诊断技术后发展的一项以分子生物学为基础的新技术，具有敏感性高、特异性强等特点。Zurbriggen等用地高辛标记的CDV N基因互补的特异性RNA做为探针，可检测到单个感染细胞中存在的目的核酸序列，特异性较强。李金中等根据Barret报道的CDV Onderstepoort株F基因序列，在国内首次建立了犬瘟热病毒RT-PCR诊断方法，并成功的应用于临床诊断。尽管此种方法具有很多优点，但核酸杂交技术受设备、操作人员等多种条件的影响而难于在临床推广。

（二）PCR技术

PCR技术能对病毒特异性核酸片段进行检测，具有敏感性高、特异性强等优点，现已广泛应用于病毒检测。其中反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断法的敏感性和特异性均高于传统诊断方法，因而RTPCR广泛应用于临床样品中的病毒检测。尤其在犬瘟热发病早期，对机体特异性免疫抗体无法检测时RTPCR非常有效。

Chulakasian等根据F基因、M基因之间非编码区的区别设计多重扩增稳定突变体系PCR方法（ARMSPCR）也能达到区分自然感染后发病还是疫苗引起的症状的目的。黄国君等和Gabriella等等分别建立SYBR Green Real-time RT-PCR和 TaqMan Real-time RT-PCR检测CDV，均获得较高的敏感性和特异性，最小检测量为100个RNA，动物的各种组织和器官均可用来检测。

四、其它实验室方法

（一）离子捕获电镜检查法

采用电镜是直接检测CDV的一种简便、快速的方法，但很难与同科的其他病毒相区别，所以一般不作为常规手段。离子捕获电镜检查法通过浓缩和提纯病毒而提高检出率，比常规电镜技术的结果好，且只需2～3 h，快速准确。常国权等用离子捕获电镜技术检测CDV，结果显著好于常规电镜技术。房红莹等改良了离子捕获电镜法，将其与免疫电镜技术结合，效果又比单纯离子捕获电镜法好，提高了完整CDV粒子的检测率。

（二）包涵体检查法

包涵体的检查是诊断CD的重要辅助方法。因为CDV与狂犬病病毒、犬传染性肝炎病毒等所形成的包涵体及细胞某些反应产物难以区分，易出现假阳性，所以还要与其它方法相结合才能确诊。未死亡的病犬，刮取鼻、眼结膜、瞬膜和膣等粘膜；死亡的犬，刮取膀胱、胆管、胆囊等黏膜。包涵体大多存在于胞浆内，一个细胞内可能有1～10个圆形或椭圆形的包涵体。程世鹏等研究发现包涵体在用强毒的狐和貂的膀胱黏膜涂片中存在，而注射疫苗组和对照组则包涵体的存在。Kolbl等在研究病犬的血液变化时发现，在染色的血液涂片中常能检出包涵体，其中淋巴细胞检出少，单核细胞、嗜中性白细胞和红细胞检出更少。

（作者单位:李忠生、冯秀娟，公安部南京警犬研究所,210012）
（王智群， 南京金盾动物药业有限责任公司,210012）