益眠达片对失眠大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响

汪涛 赵雁平 胡卫东 高永喜 刘辉 曾凡波

·实验研究·

益眠达片对失眠大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响

汪涛 赵雁平 胡卫东 高永喜 刘辉 曾凡波

目的观察益眠达片对失眠大鼠下丘脑单胺类神经递质含量的影响，探讨其治疗失眠的作用机制。方法

将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、益眠达片组，艾司唑仑组，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠均用对氯苯丙氨酸建立大鼠失眠模型。益眠达片组和艾司唑仑组分别给予益眠达片和艾司唑仑混悬液灌胃，其余2组给予生理盐水灌胃。6 d后，采用荧光分光光度计测定下丘脑内去甲肾上腺素（NE）及5-羟色氨（5-HT）、5-羟吲哚醋酸（5-HTAA）含量。结果与模型对照组比较，益眠达片组可以降低大鼠下丘脑内NE含量、升高下丘脑内5-HT、5-HTAA含量 （P＜0.01）。结论益眠达片改善失眠大鼠唾眠的机制与其影响大鼠下丘脑内单胺类神经递质含量有关。

益眠达片；失眠；大鼠；单胺类神经递质

益眠达片为解放军武汉疗养院研制开发的纯中药制剂，具有益气生津，安神补脑，镇静安眠作用。用于治疗失眠、多梦、神经衰弱等症。与传统治疗失眠的苯二氮艹卓类药物相比，益眠达片的镇静催眠的作用机理可能有所区别，本研究以PCPA大鼠失眠模型为研究对象，观察益眠达片对大鼠下丘脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）及5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HTAA）含量的影响，探讨其镇静催眠作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级健康W istar雄性大鼠40只，体质量（200±20）g，同济医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（鄂）2010-0009。提前1周将大鼠饲养在12 h光照（7：00-19：00时）、12 h黑暗（19：00-7：00时）的安静环境下，自由摄食饮水，室温（24±2）℃，相对湿度40%～60%。60只大鼠按照随机数字表分为4组各15只，分别为益眠达片组、空白对照组、模型对照组、艾司唑仑组。

1.2 仪器与试剂 日本岛津荧光分光光度计，RC5C低温高速离心机 （美国杜邦公司），FA2204B电子分析天平（上海台衡电子衡器有限公司）。益眠达片由合欢皮、首乌藤、五味子等组成，由中国人民解放军武汉疗养院制剂室提供，生产批号131108，规格0.3 g／片，用前用蒸馏水配制成浓度为0.24 g／m L的混悬液。艾司唑仑片 （华中药业股份有限公司生产，批号：20120805）。对氯苯丙氨酸（PCPA，批号C6506）、5-羟色胺标准品、5-羟吲哚乙酸标准品、去甲肾上腺素标准品均购自美国SIGMA公司；0.9%NaCl注射液（武汉滨湖双鹤药业有限责任公司生产，批号130416804）；邻苯二甲醛（OPT）购自北京舒伯伟化工仪器有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.3 失眠大鼠模型制备 除空白对照组外，其余各组大鼠参照文献［1］并结合预实验结果，按300 mg／kg体质量以10 m L／kg体积腹腔注射PCPA，于每日上午8：00-8：30点进行，1次／d，连续2 d。于第1次腹腔注射28～30 h后，动物出现昼夜节律消失，白天活动不停，整体观察与正常对照组有明显不同，表明模型复制成功［2］。

1.4 给药方法 各组大鼠于造模第3日开始每日8：00灌胃给药。益眠达片组大鼠每天按12.0 g／kg（为成人用量10倍）灌胃；艾司唑仑组大鼠每天按0.3mg／kg（为成人用量10倍）灌胃给予艾司唑仑；空白对照组、模型对照组予等量生理盐水，1次／d，连续灌胃6 d。

1.5 大鼠下丘脑内NE含量的测定 参照文献［3］方法将大鼠脱颈椎处死，取脑，放在预先冰冷的生理盐水中，去除脑膜血管。在冰冷平皿上分离下丘脑，称重；放在预先冰冷的玻璃匀浆器中，加5 m L酸性正丁醇，匀浆，1 500 r／m in离心10 m in，吸上层正丁醇2 m L加入含有1.5 m L磷酸0.1 mol／L缓冲液（pH 6.5）的具塞离心管中，振摇10 m in，NE被抽提到缓冲液中。取1.5 m L上述磷酸提取液按文献方法与氧化碘试剂进行反应，反应液在荧光计上以385 nm激发、485 nm、狭缝5处测定荧光强度。试剂空白和组织空白是将氧化剂和还原剂加入次序颠倒，其他步骤不变。根据标准曲线将各组荧光读数转化为浓度值，进行统计学处理。

1.6 大鼠下丘脑内5-HT、5-HIAA含量测定下丘脑分离同上。参照文献［4］方法，组织称重后立即置于含有冷酸性正丁醇（100 mg组织／1 m L正丁醇）匀浆器中，在冰浴条件下匀浆后，离心（3 000 r／min，5 min），吸取5 m L×2上清液，分别加到两支带塞离心管中，分离5-HT、5-HTAA。被提取的5-HT、5-HTAA与OPT作用后，在激发光365 nm、发射光480 mim、狭缝5条件下测定样品的荧火强度。按文献同时制备标准管、样品空白管。按公式计算5-HT、5-HTAA含量，并进行统计学处理。

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，实验数据以 （±s）表示，多组间比较采用方差分析，并进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PCPA化失眠大鼠下丘脑内NE含量比较 益眠达片组大鼠下丘脑内NE含量明显低于空白对照组及模型对照组 （P＜0.05或P＜0.01），说明益眠达片可以降低大鼠下丘脑内NE含量。见表1。

2.2 各组PCPA化失眠大鼠下丘脑内5-HT、5-HIAA含量比较 模型对照组大鼠下丘脑内5-HT、5-HTAA含量明显低于空白对照组，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；益眠达片组下丘脑内5-HT、5-HTAA含量较模型对照组有显著性升高（P＜0.01），与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 PCPA化失眠大鼠下丘脑内NE、5-HT、5-HIAA含量比较（±s）

表1 PCPA化失眠大鼠下丘脑内NE、5-HT、5-HIAA含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05

15 18.24±3.67 0.89±0.34 0.23±0.12模型对照组 15 19.56±2.93 0.71±0.29a0.17±0.09a益眠达片组 15 15.18±2.75ab1.05±0.31b0.24±0.11b艾司唑仑片组15 14.61±3.84ab1.10±0.42b0.25±0.23 -HIAA空白对照组组别 只数 NE 5-H t 5 b

3 讨论

失眠是人体最为常见的睡眠-觉醒节律紊乱［5］，NE与5-HT是公认的参与睡眠-觉醒机制的经典神经递质［6］，而5-HIAA是脑内5-HT的主要代谢途径。研究表明，脑内5-HT有增加睡眠作用［7-9］，而NE在维持觉醒中起着重要作用。NE对中枢神经元既有兴奋又有抑制作用，在特定的部位有其特定的作用，常以兴奋作用为主。5-HT多呈抑制效应，脑干中的5-HT有利于维持慢波睡眠，而慢波睡眠又有利于疲劳的恢复［10］。本研究采用目前较公认的失眠模型PCPA化大鼠，探索益眠达片对失眠大鼠下丘脑内主要单胺类神经递质的影响，以期明确该方在脑内神经递质方面的作用机制。结果显示，服药6天后，益眠达片可降低大鼠下丘脑内NE含量，恢复失眠大鼠下丘脑5-HT和5-HTAA含量。这可能是益眠达片治疗失眠的内在机制之一。

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Influence of Yimianda tablets on the contents of monoamines neurotrans mitters in hypothala-mus of insomniarats

Wang Tao，Zhao Yanping，Hu Weidong，Gao Yongxi，Liu Hui，Zen Fanbo.*People’s Liberation Army Wuhan Sanatorium 430074，China

ObjectiveThe influence of Yimianda tablets on the contents of monoam ines neurotransmitters in Hypothalamus of insomnia rats，to explore themechanism of curative effect of Yim ianda tablets.Methods40W istar ratswere randomized into the blank control group，model group，Yim ianda tablets group，and Estazolam group，each group had 10 rats.The experimentalmodelof insomnia ratswas induced by PCPA.The rats of Yim ianda tablets group give Yimianda Suspension gavaged，The rats of Estazolam group give Estazolam Suspension gavaged.The rats of blank control group and model group give NS gavaged.After 6 days，used fluorescence spectrophotometer determ ined the contents of NE、5-HT、5-HTAA in the hypothalamus of insomnia rats.ResultsCompare with themodel group’s rats，the Yim ianda tablets group’s rats’the contents of NE was reduced and the contents of 5-HT、5-HTAA was increased in the hypothalamus（P＜0.01）.ConclusionThe mechanism of Yimianda tablets’improve insomnia related to influence the contents ofmonoam ines neurotransm itters in hypothalamus of insomnia rats.

Yim ianda tablet；Insomnia；Rat；Monoam ines neurotransm itters

430074广州军区武汉疗养院（汪涛、胡卫东、高永喜、赵雁平）；430072广州军区武汉总医院（刘辉）；430030华中科技大学同济医学院药学院 （曾凡波）