葡萄皮DNA检验

2014-04-24王凤宽王传海李湘秦

中国刑警学院学报 2014年1期

关键词：消化液盗窃案硅胶

王凤宽杜舟王传海李湘秦吴勇

（深圳市公安局刑事科学技术研究所广东深圳 518040）

葡萄皮DNA检验

王凤宽杜舟王传海李湘秦吴勇

（深圳市公安局刑事科学技术研究所广东深圳 518040）

葡萄皮作为较少见生物物证的一种，在犯罪现场时有发现并提取，由于葡萄皮上附有的人口腔脱落细胞DNA含量较低并存在多种PCR扩增抑制因素，荧光STR检测成功率较低。对在入室盗窃案现场发现的葡萄皮用骨骼裂解液裂解提取，并用QIAquickRPCR Purification Kit硅胶膜过柱法富集纯化DNA，获得理想STR分型结果并通过DNA数据库比中嫌疑人，从而通过对葡萄皮DNA的成功检验在案件侦破、诉讼中发挥重要作用。

葡萄皮 STR QIAquickRPCR Purification Kit硅胶膜过柱法

1 案例资料

1.1 简要案情

2012年9月26日，居住在深圳市光明新区光明街道办事处新陂头村篮球场旁出租屋的广西人覃××报案称，当日18时30分许下班回到住处发现被盗，现场勘查了解覃××家中冰箱内的一串葡萄不见了，室内地上有散在的怀疑为嫌疑人吃葡萄后丢弃的紫色葡萄皮，技术人员收集提取葡萄皮送检。

1.2 DNA提取及检验

取干净剪刀、镊子，将完整一个吃剩的葡萄皮剪碎，装入1.5ml Eppendorf管，加入260ul骨骼裂解液（Bone Incubation Buffer，美国Promega公司），30ul 20mg/ml蛋白酶K，10ul 1M DTT，震荡10sec充分混匀，56℃消化1h，期间震荡1-2次，每次10sec。瞬时离心，取 3ul用 AmpFLSTRRIdentifilerRPlus试剂盒（AB公司，美国）直接扩增，余消化液和载体通过吊篮式离心去除载体转移收集消化液至新的1.5ml Eppendorf管中备用。

用德国QIAGEN公司QIAquickRPCR Purification Kit纯化试剂盒进行纯化浓缩。

加入5倍体积的Buffer PB（Binding buffer）至含消化液的1.5mlEppendorf管中，震荡混匀；取一个新的带有2ml收集管（2ml collection tube）的纯化柱（QIAquickRSpin Column），吸取700ul混合液至纯化柱，8000rmp离心1min，丢弃已滤过的液体（管不换）；重复此操作直到混合液全部滤过；吸取700ul已配无水乙醇的Buffer PE（Wash buffer）至纯化柱，13000rmp、1min离心洗涤1次，丢弃收集管中已滤过的液体；吸取80%乙醇700ul至纯化柱，13000rmp、1min离心洗涤1次，丢弃收集管中已滤过的液体；再以13000rmp离心3min，甩干残余液体后把纯化柱放置于新的1.5ml Eppendorf管上，打开纯化柱盖子室温挥发2min；将已在65℃预热的Buffer EB（Elution buffer） 30ul直接加入到纯化柱的硅胶膜，65℃孵育2min，13000rmp离心2min，收集于1.5ml Eppendorf管，取3ul用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus试剂盒扩增（AB公司，美国），3130xl型遗传分析仪（AB公司，美国）电泳，GeneMapperID V3.2分析判型。

1.3 数据库比对和结果判定未纯化浓缩前的样品直接扩增未检出STR分型。用QIAquickRPCR Purification Kit纯化试剂盒纯化浓缩后样品检出STR分型。

分型结果录入全国DNA数据库后与2011年12月9日光明新区公明街道塘尾面前岭1排8栋的潘××被盗窃案的现场烟头通过DNA串并案，并比中广西壮族自治区河池市罗城仫佬族自治县东门镇的前科人员吴×福。

2 讨论

由于葡萄皮本身面积太小，为吸附性载体，上面附有的少量口腔上皮脱落细胞不宜用棉签、纱布等擦拭转移，直接消化应为较好选择。葡萄皮的主要成分为纤维素、果胶质、铁等，葡萄皮呈紫色是因为葡萄皮含有花青素。经骨骼裂解液的消化裂解后，葡萄皮成为糊状，释放出有机酸等物质抑制PCR反应，消化液颜色变为了紫色，需要浓缩富集DNA。直接取裂解后的3ul DNA溶液用AmpFLSTRRIdentifilerRPlus试剂盒扩增未检出结果，说明葡萄皮含有的色素、经骨骼裂解液消化裂解后产生的有机酸及其他成分对扩增有抑制作用。故选择合适的纯化浓缩方法成为葡萄皮上DNA检验能否成功的关键因素。

德国QIAGEN公司的QIAquickRPCR Purification Kit纯化试剂盒原用于纯化片段大小在100bp-10kb之间的PCR扩增产物，最大处理量为10ug以便于后期测序。通过法医DNA检验测试，该纯化试剂盒在PCR扩增前对疑难微量检材、陈旧骨骼牙齿样本等的扩增前纯化浓缩也取得了很好的效果，由于该纯化试剂盒完全手工操作，不需要大型昂贵仪器设备，在全国公安法医DNA实验室应用广泛。通过方便的结合-洗涤-洗脱步骤可快速纯化目标DNA片段，先将已消化裂解的DNA样本加入5倍体积的Buffer PB、混匀，以增强滤过时目标DNA与纯化柱硅胶膜的充分完全结合，通过离心初步去除DNA样本中的杂质、抑制剂，再通过Buffer PE（试剂瓶中55ml的Buffer PE使用前预先加入220ml的无水乙醇并混匀后方可使用）、80%乙醇洗涤去除附在硅胶膜上的少量残余杂质、抑制剂，此时硅胶膜上只结合有纯净的目标DNA，然后再通过已在65℃预热的30ul Buffer EB从硅胶膜柱上充分完全洗脱下来扩增备用。

葡萄皮作为非传统生物物证在犯罪现场由于体量小较少有被发现和提取，而且因为STR检出成功率较低，国内外报道不多，本文由于现场勘查时及时发现并提取送检，采用了纯化浓缩DNA效果较好的QIAquickRPCR Purification Kit硅胶膜过柱法处理检材，得到正确STR分型结果，并通过DNA数据库串并案件和直接比中犯罪嫌疑人，发挥了重要作用。